贺兰山东麓产区一株新型苹果酸-乳酸发酵细菌的酿酒适应性分析

祁 璇1,2，刘 思3，郑浩博4，许引虎5,6，马 雯1,2,*，金 刚1,2,*

（1.宁夏大学葡萄酒与园艺学院，宁夏 银川 750021；2.葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心，宁夏 银川 750021；3.宁夏莱恩堡葡萄酒业有限公司，宁夏 银川 750200；4.宁夏大学化学化工学院，宁夏 银川 750021；5.农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，湖北 宜昌 443003；6.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

近年来，我国葡萄酒产量已跃居世界前十位，为国民经济尤其是西部地区农业和农村经济发展做出了积极贡献。宁夏贺兰山东麓产区酿造葡萄酒的自然条件优越，目前已成为世界热门的葡萄酒产区，蕴含着丰富的酿酒微生物资源，对其进行开发与利用，既可有效降低葡萄酒生产成本，又可保留产区葡萄酒的风土特征。随着全球气候变暖和葡萄采摘时成熟度的增加，一些原本气候温暖的产区酿酒葡萄原料的含糖量和潜在乙醇体积分数不断升高。乙醇是抑制苹果酸-乳酸发酵细菌（MLB）生长和苹果酸-乳酸发酵（MLF）进行的主要因素之一，通常情况下，乙醇体积分数超过14%时一些MLB的生长就会受到抑制，而目前很多产区包括贺兰山东麓产区酒精发酵后葡萄酒的乙醇体积分数经常超过15%甚至更高，使得葡萄酒MLF的完成变得越来越困难。目前，MLF是酿造优质葡萄酒必不可少的工艺，它通过降低酸度、增强微生物稳定性和丰富香气改善葡萄酒的口感和风味。因此，选育乙醇耐受性好的优良MLB对于解决目前气候炎热产区葡萄酒MLF面临的威胁和挑战具有重要意义。

我国对MLF的研究起步较晚，对优良MLB在生产上应用的重视程度不够。国内有关研究主要集中在酒酒球菌（Oenococcus oeni）上，尽管酒酒球菌更适应传统葡萄酒低pH值和中低乙醇体积分数的生境，但全球气候变暖导致的乙醇体积分数和pH值升高使得MLB面临生境的巨大变化，给葡萄酒MLF带来了新的挑战。在这种新的逆境生态条件下，乳杆菌属（Lactobacillus）尤其是耐受高乙醇体积分数的菌株，显示出更强的适应性。有些乳杆菌属菌株具有较强的逆境耐受性，能在发酵后给葡萄酒质量带来积极影响，如提高稳定性、增加香气复杂性、改善口感等。一些研究表明，在葡萄酒MLF过程中，乳杆菌属细菌产生初级代谢产物的能力远强于酒酒球菌，使得乳杆菌属细菌在葡萄酒新的逆境生态中具有潜在的优势。为应对全球气候变暖带来的挑战，对乳杆菌属细菌的抗逆性研究已成为葡萄酒微生物学和工艺学研究的重要内容。

越来越多的研究表明，乳杆菌属细菌特别是植物乳植杆菌（Lactobacillus plantarum）和希氏乳杆菌可能更适合在低pH值和高乙醇体积分数的葡萄酒中进行MLF并产生与酒酒球菌不同的有益物质。金刚从澳大利亚巴罗莎产区筛选出3 株对高乙醇体积分数有良好抗性的L. hilgardii（G76、G102、G103），可在乙醇体积分数高达19%的MRS-AJ培养基中存活并增殖。Knoll等研究发现，希氏乳杆菌具有完成MLF的能力，且与商业酒酒球菌具有相同的MLF发酵速率。与酒酒球菌相比，乳酸杆菌还拥有更多的酶编码基因，能产生更多的糖苷酶、蛋白酶、酯酶、酚酸脱羧酶和柠檬酸盐裂解酶等，对葡萄酒香气化合物的产生有重要影响，上述研究表明L. hilgardii可能是潜在的适合于高乙醇体积分数葡萄酒MLF的MLB。

宁夏大学葡萄酒与园艺学院的祁璇、马雯*、金刚*等从宁夏贺兰山东麓产区赤霞珠干红葡萄酒自然MLF过程中分离纯化出一株MLB，通过16S rRNA序列分析和全基因组测序分析鉴定为希氏乳杆菌，命名为Q19，为了解其逆境胁迫耐受能力和应用潜力，以商业菌株O. oeni 31-DH为对照，对其乙醇、二氧化硫和pH值胁迫耐受性和酿酒适应性进行研究和分析，研究结果对开发我国本土酿酒微生物资源、降低我国葡萄酒生产成本、提高质量、开发特色优质葡萄酒具有重要意义。

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赤霞珠干红葡萄酒自然发酵过程中MLB的分离鉴定

 

在赤霞珠葡萄酒自然发酵过程中取样，通过稀释涂平板法分离并纯化乳酸菌菌株，其中一株分离菌株的菌落形态明显不同于其他分离菌株，该菌在MRS固体培养基上菌落较小，呈乳白色，圆形，湿润，表面光滑，边缘不规则，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性，显微镜下观察细胞呈短杆状，两端呈圆柱，单个不成链，无荚膜，无鞭毛（图1）。16S rRNA序列分析结果表明该菌与希氏乳杆菌的同源性最高（登录号：PX204945），同时全基因组测序也显示其为希氏乳杆菌（Lentilactobacillus hilgardii），将其命名为Q19（登录号：JBQPVX000000000）。

02

L. hilgardii Q19的胁迫耐受性分析

           

2.1 L. hilgardii Q19的乙醇胁迫耐受性分析

由图2可以看出，L. hilgardii Q19表现出较强的耐乙醇能力。在15%乙醇体积分数条件下培养48 h后L. hilgardii Q19菌体快速生长；17%乙醇体积分数胁迫条件下，在前12 h菌体生长缓慢，可能在其适应乙醇胁迫的过程中，乙醇影响了部分活菌细胞膜结构和能量供应途径，使其代谢过程发生改变导致菌体死亡，但在12 h后菌体生长加快，表明L. hilgardii Q19适应了乙醇胁迫环境；19%乙醇体积分数胁迫条件下，L. hilgardii Q19能够存活并增殖。葡萄酒酒精发酵后乙醇体积分数通常达到12%～14%，不同乳酸菌对乙醇耐受程度不同，已有研究表明，大多数乳酸菌的乙醇耐受上限约为14%（V/V）。乳酸杆菌比酒酒球菌更能耐受高乙醇体积分数，当乙醇体积分数为10%，L. plantarum R1-1与O. oeni 13-7的滞后期持续2 d，乙醇体积分数增加到14%，L. plantarum R1-1的滞后期延长至4 d，O. oeni 13-7延长至5 d。在气候炎热的产区，乙醇体积分数进一步升高已成为MLF启动困难甚至失败的常见瓶颈。L. hilgardii Q19能够在15%乙醇体积分数条件下保持正常增殖，并在19%乙醇体积分数条件下存活且最高生长量达到OD₆₀₀≈0.18，优于传统酒酒球菌、植物乳植杆菌等常用MLF菌株，为解决高乙醇体积分数葡萄酒中MLF缓慢甚至无法正常启动的情况提供了可行方案。

 

2.2 L. hilgardii Q19的pH值胁迫耐受性分析

由图3可以看出，L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH都可以在pH 3.6的条件下生存，L. hilgardii Q19菌体在24～60 h快速生长；当pH值为3.3时，L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH在0～60 h无明显区别且生长都处于上升趋势，在60～108 h，L. hilgardii Q19菌体快速生长，表明此时L. hilgardii Q19已经适应了pH值胁迫，呈现出良好的耐受性，这可能意味着L. hilgardii Q19能通过调整代谢途径和酶活性适应酸性环境；在pH 3.1时，L. hilgardii Q19能够存活并增殖。pH值是影响乳酸菌生长和其代谢终产物种类及浓度的重要因子，大多酒球菌属和乳杆菌属菌株生长代谢最适pH值接近中性，而葡萄酒pH值通常在3.5以下，这对于MLB的生长代谢而言是极大的挑战。pH值越低，对乳酸菌的生存和生长影响越大，当pH值低于3.2时，MLB启动MLF困难；当pH值低于3.0时，MLB可能出现生长停滞甚至失活的现象。因此，只有少数耐低pH值的乳酸菌能适应葡萄酒的环境，包括酒球菌属、乳杆菌属、片球菌属及肠膜明串珠菌属的部分种类，其中酒酒球菌的低pH值耐受能力最强，乳杆菌适应较高的pH值环境，随着全球气候变暖和葡萄酒pH值的上升，乳杆菌也越来越适应于在葡萄酒环境中生存和进行MLF，因此，目前及未来葡萄酒生产中，L. hilgardii Q19具有很好的应用潜力。

 

2.3 L. hilgardii Q19的SO₂胁迫耐受性分析

SO₂浓度会影响MLB生长代谢。在葡萄酒酿造过程中，通过添加SO₂以期达到防止葡萄酒氧化、抑制杂菌、控制葡萄酒微生物菌群的目的。SO₂质量浓度高于40 mg/L时，抑制MLB的生长；SO₂质量浓度高于60 mg/L时，MLF的进行无法得到保证。由图4可以看出，在SO₂质量浓度20 mg/L时，在0～48 h，L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH处于缓慢增长阶段，在48 h后L. hilgardii Q19快速生长，而O. oeni 31-DH缓慢增长；SO₂质量浓度40 mg/L时，0～96 h，二者均缓慢增长，96 h后L. hilgardii Q19生长加快，表明L. hilgardii Q19可能已经适应了SO₂的环境。García-Ruiz等研究发现SO₂对酒酒球菌和希氏乳杆菌生长产生抑制，与L. hilgardii相比，SO₂对O. oeni的抑制作用高出10 倍，表明O. oeni对SO₂的耐受性较差，可能会影响到它在葡萄酒中的活性和MLF的效果，而L. hilgardii表现出更高的SO₂耐受性，使其在葡萄酒发酵过程中更具优势。当SO₂质量浓度高于60 mg/L时，二者的生长趋势均受到抑制，表明在葡萄酒陈酿和储存过程中可通过控制SO₂的浓度，有效抑制L. hilgardii Q19，从而确保接种L. hilgardii Q19进行MLF后葡萄酒微生物的稳定性与安全性。

 

03

L. hilgardii Q19的酿酒特性分析

 

3.1 L. hilgardii Q19在模拟酒和葡萄酒中的发酵实验

为了解L. hilgardii Q19在模拟酒和葡萄酒中的发酵性能，开展了相关发酵实验。图5a显示，5 d结束时模拟酒中苹果酸质量浓度降至0.15 g/L以下，表明此时L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH发酵速度相近。将L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH分别接种到模拟酒中，其活菌数均呈现先快速增长后逐渐下降的趋势，并在第3天达到峰值10⁸ CFU/mL以上。二者的生长曲线显示，模拟酒中L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH在1～3 d活菌数增加，3 d后活菌数降低，且2 d后O. oeni 31-DH的活菌数均高于L. hilgardii Q19。图5b结果显示，在葡萄酒中，L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH的活菌数均呈现下降趋势，但L. hilgardii Q19菌株下降趋势相对缓慢，且其活菌数在后期始终高于O. oeni 31-DH。表明真实的葡萄酒环境比模拟酒环境面临更复杂的胁迫条件，而L. hilgardii Q19在此环境中展现出更强的适应性和耐受性。虽然活菌数都呈下降趋势，但两种菌株在发酵过程中活菌数都始终保持在10⁶ CFU/mL以上。综上，相较于O. oeni 31-DH，L. hilgardii Q19在应对葡萄酒酿造过程中的多重胁迫因素时，展现出更好的适应性，凸显了其在强胁迫条件下特别是高乙醇体积分数葡萄酒中的应用潜力，且L. hilgardii Q19作为从本土筛选的MLF菌株，能更好地适应本土的葡萄酒环境条件，并有助于增强葡萄酒的本土特色和身份标识。

为了解发酵前后葡萄酒各项理化指标，对接种L.hilgardii Q19和O. oeni 31-DH发酵前后的葡萄酒进行了分析。由表1可以看出，在模拟酒中接种L. hilgardii Q19进行MLF后酒的pH值及L-乳酸含量与接种O. oeni 31-DH发酵后无明显差异。由表2可知，干红葡萄酒酒精发酵结束后接种L. hilgardii Q19会导致总酸、L-苹果酸和柠檬酸含量降低，主要是由于MLF过程中L-苹果酸脱羧生成L-乳酸，以及乳酸菌消耗柠檬酸产生其他化合物；与赤霞珠干红葡萄酒酒精发酵结束后基本理化指标相比，接种L. hilgardii Q19发酵后葡萄酒的柠檬酸含量没有明显变化，可能因为在发酵过程中的L. hilgardii Q19代谢活动保持了一定的稳定性，没有显著的柠檬酸积累或消耗，而接种O. oeni 31-DH进行MLF后柠檬酸含量降低，可能会导致葡萄酒清爽感降低，挥发酸升高，不利于葡萄酒质量的改善。

3.2 接种L. hilgardii Q19进行MLF对葡萄酒香气的影响

乳酸菌引起的MLF对葡萄酒香气有重要影响。为了解接种L. hilgardii Q19进行MLF对葡萄酒香气的影响，对发酵前后葡萄酒的挥发性物质种类和含量进行了分析。由表3可以看出，接种L. hilgardii Q19进行MLF后葡萄酒的挥发性成分有56 种，发酵后的挥发性物质总质量浓度为13.781 mg/L，接种O. oeni 31-DH发酵后葡萄酒的挥发性成分只有33 种，发酵后葡萄酒的挥发性物质总质量浓度为8.227 mg/L。其中L. hilgardii Q19发酵产生的醇类物质有11 种，相比O. oeni 31-DH多4 种。L. hilgardii Q19发酵产生的酯类物质有34 种，多于O. oeni 31-DH（16 种），且L. hilgardii Q19发酵后的酯类物质质量浓度（6.704 mg/L）显著高于O. oeni 31-DH发酵后的质量浓度（1.728 mg/L）。香气是体现葡萄酒产品风格和特征的重要指标。不同乳酸菌的生理活性及代谢有很大差异，MLF后产生的风味物质组成也不同。高级醇是影响葡萄酒香气的重要化合物，其质量浓度低于300 mg/L时会增加葡萄酒香气的复杂性，而超过400 mg/L时会对葡萄酒香气产生负面影响。本研究中，接种L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH后，葡萄酒中产生的高级醇质量浓度均低于300 mg/L，一些被认为具有较高气味强度的挥发物，如异戊醇，适当的浓度可以对葡萄酒产生积极的影响，如提供花香、蜂蜜和水果的香气。酯类物质是葡萄酒香气的主要贡献者，可以提高葡萄酒的香气复杂性。一般而言，酯类对葡萄酒的香气有积极影响，如乙酸酯（乙酸己酯、乙酸异戊酯和2-苯基乙酸乙酯）可为葡萄酒提供蜂蜜香、果香和花香；接种L. hilgardii Q19的葡萄酒中的辛酸乙酯和己酸乙酯，共同赋予葡萄酒明显的柑橘类果香；而月桂酸乙酯和2-乙酸苯乙酯等则增强了奶油般的圆润香气，使葡萄酒香气更加丰富、复杂且具有层次感，而过量的酯类也会对葡萄酒的质量产生负面影响，可能会掩盖葡萄的品种香气、简化成品酒的香气成分或破坏葡萄酒。综上，接种L. hilgardii Q19和O. oeni 31-DH葡萄酒香气成分主要由醇类和酯类物质组成，其中接种L. hilgardii Q19相对于接种O. oeni 31-DH所独有的1-壬醇、乙酸己酯等的含量均超过阈值，会赋予葡萄酒一定的花香、果香，增加了葡萄酒香气的复杂性。

 

04

结 论

 

本研究对宁夏贺兰山东麓产区赤霞珠葡萄酒MLF过程中的MLB进行了分离、纯化，经过表型、生理生化、16S rRNA序列分析和全基因组测序分析鉴定了1 株希氏乳杆菌，并命名为Q19。L. hilgardii Q19具有较好的乙醇、pH值及二氧化硫胁迫耐受性，特别是具有较强的乙醇胁迫耐受性。在接种到模拟酒和未经MLF的葡萄酒中发酵时，与对照O. oeni 31-DH的发酵速度相近，发酵过程中活菌数始终在10⁶ CFU/mL以上，发酵后葡萄酒中挥发性物质的种类更丰富且总含量更高，其中己酸乙酯、辛酸乙酯、2-乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯等物质含量较高，赋予葡萄酒独特的花香、果香等香气特征。这些研究结果表明L. hilgardii Q19能在高体积分数乙醇的条件下启动并完成MLF，并能提升葡萄酒的香气质量，为高乙醇体积分数葡萄酒的MLF提供了解决方案，具有很好的应用潜力。

引文格式：祁璇, 刘思, 郑浩博, 等. 贺兰山东麓产区一株新型苹果酸-乳酸发酵细菌的酿酒适应性分析[J]. 食品科学, 2025, 46(23): 160-168. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250609-047. 

QI Xuan, LIU Si, ZHENG Haobo, et al. Winemaking adaptability of a novel malolactic bacterial strain from the wineproducing region of the eastern foothill of Helan Mountain[J]. Food Science, 2025, 46(23): 160-168. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250609-047.