Food Chem：梅洛与赤霞珠葡萄汁及年轻葡萄酒中干果香气的分子解析：过熟的影响

梅洛与赤霞珠葡萄汁及年轻葡萄酒中干果香气的分子解析：过熟的影响

期刊：Food Chemistry（9.8）

发表日期：2018年

 

 

研究背景

 

葡萄浆果中的化合物在酿酒过程中会发生释放或生物转化，其相对分布特征决定了葡萄酒品种特征的呈现，构成了葡萄酒典型性的基础。21世纪初以前，干果风味（无花果干、杏干、西梅干）在波尔多红葡萄酒中鲜有检出，如今却在葡萄汁和年轻红葡萄酒中日益常见。这一现象与葡萄平均成熟度显著提高密切相关，既受局部气候变迁的影响，也与葡萄种植方式的改变有关。事实上，这类风味特征过去更常见于温暖的南方产区葡萄酒，或通过葡萄脱水、葡萄加强酒等传统工艺酿造的红葡萄酒中。此外，正如在全球其他葡萄园观察到的那样，这些风味变化也反映了全球变暖带来的生物学影响。

用过熟或脱水葡萄酿造的红葡萄酒会呈现出干果风味特征，这一现象在多个葡萄品种中均有报道。由于这类风味特征广泛存在于各类红葡萄酒中，学者们已开展大量研究以鉴定其关键挥发性化合物。例如，3-甲基-2,4-壬二酮（MND）已被证实与氧化型红葡萄酒的干果香气相关。近期研究中，通过添加甲硫基丙醛进行香气重组实验发现，该物质可将红葡萄酒的新鲜水果风味转化为干果特征。最新研究发现了两种新化合物对带有熟果和干果风味的红葡萄汁的感官影响，这两种化合物均为首次报道：一种是马索亚内酯（具有椰子和无花果干香气），另一种是（Z）-1,5-辛二烯-3-酮（具有天竺葵香气）。

然而，针对梅洛和赤霞珠葡萄及葡萄酒中特定干果风味（无花果干或西梅干特征）的分子标志物鉴定研究仍较为匮乏。本研究旨在探究葡萄汁和葡萄酒中与干果风味相关的特定化合物的存在情况，并提供过熟对这类香气化合物形成影响的新数据。

 

材料与方法

 

2.1.葡萄、葡萄汁及葡萄酒的来源

本研究选取欧亚种葡萄（VitisVinifera L.）中的梅洛（Merlot）和赤霞珠（Cabernet Sauvignon）品种，用于鉴定与干果特征相关的化合物（表1）。葡萄样品采自波尔多地区多个产区的酒庄，涵盖2011年、2012年及2015年三个年份。采收采用人工方式，剔除地块中可能存在的灰霉病感染果或脱水果；葡萄运至酒庄后，通过分选台再次核查果实外观品质。酿酒过程遵循标准流程，采用商业活性干酵母和商业乳酸菌菌株分别进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵。

 

 

2.2.人工葡萄脱水过程

人工气候箱脱水实验选用2012年份波尔多地区多个酒庄的梅洛和赤霞珠葡萄。处理前葡萄的基本理化指标如下：梅洛葡萄可溶性固形物含量20.8°brix、pH 3.90、可滴定酸度2.0 g/L、苹果酸含量1.6 g/L；赤霞珠葡萄可溶性固形物含量19.7°brix、pH3.65、可滴定酸度3.7 g/L、苹果酸含量3.7 g/L。

将梅洛和赤霞珠葡萄置于Climacell型气候培养箱中，设定温度为30℃（±0.3℃）、相对湿度（RH）为30%（±3%）。每次实验中，30串葡萄悬挂于挂钩上并保持间距，确保空气流通以防止灰霉类霉菌滋生。在实验起始时间（t=0）将葡萄放入预热后的培养箱中，每日定时取出所有葡萄称重，监测水分流失情况。人工脱水过程持续至葡萄平均水分流失率达到35%。过熟葡萄汁及未过熟对照葡萄汁均在二氧化碳保护下通过轻柔手工压榨获取，压榨后经离心处理。

 

2.3.脱水期间光照对葡萄汁及葡萄酒香气化合物的影响

每个处理组选用2015年份梅洛和赤霞珠葡萄各约1 kg，平铺于托盘上。称量托盘重量后，将其置于上述气候培养箱中。通过6支15 W（7500 lx）荧光灯管在30℃条件下照射样品，以探究光照对葡萄汁及葡萄酒风味的影响。葡萄串保持间距，避免培养箱内湿度导致灰霉类霉菌滋生。一半果实暴露于光照下，另一半用铝箔包裹遮光。通过数字温度计进行预实验验证，确保无论是否光照，果实内部温度均保持稳定。人工脱水至葡萄平均水分流失率达35%后，在二氧化碳保护下手工压榨过熟及未过熟果实，获取葡萄汁以防止氧化，经离心处理后，取150 mL葡萄汁样品用于挥发性化合物检测，剩余样品进行发酵。

 

2.4.检测与分析方法

香气提取：液-液萃取（二氯甲烷）、顶空固相微萃取（HS-SPME，PDMS/DVB纤维）；

鉴定与定量：GC-O-MS（BPX5/BP20色谱柱）、离子阱质谱，内标法（3-辛醇、2-辛醇、乙基麦芽酚）定量；

感官分析：10名专业品鉴员，3-AFC法测定气味阈值，0-10 cm线性量表评价干果香气强度（>5分为DF组，≤5分为对照组）；

统计分析：R软件进行ANOVA、Kruskal-Wallis检验，显著性水平α=5%。

 

研究结果

 

3.1.鉴定具有干果风味特征样品的特征气味区域（OZ）

对具有干果风味（DF组）、无干果风味（对照组，C组）的葡萄汁及葡萄酒以及实验室可控条件下脱水（DG组）、具有干果风味的葡萄汁及葡萄酒进行GC-O-MS分析。

对照组葡萄汁的有机萃取物中检测到20个气味区域（OZ），而DF组葡萄汁中检测到50个。红葡萄酒的检测结果类似：对照组中检测到35个气味区域，具有干果风味的葡萄酒中检测到75个。总体观察发现，当样品呈现干果风味时，描述为“青味”或“青草味”的气味区域数量减少，而描述为干果风味的气味区域数量增加。因此，GC-O-MS分析证实了葡萄汁和葡萄酒中存在与干果香气相关的特定气味区域（表1）。此外，具有明显干果香气的葡萄汁中的气味区域与脱水处理葡萄汁及葡萄酒中的气味区域相似（表1）。由此可见，实验室条件下葡萄采后脱水处理形成的气味区域分布，与田间过熟葡萄的气味区域分布一致。

最后，通过非极性（BPX5）和极性（BP20）毛细管柱进行气味区域分布分析，结果显示具有干果风味的葡萄汁和葡萄酒中存在22个特征气味区域（表1）。其中大部分气味区域仅在DF组葡萄汁和葡萄酒样品中检测到；相反，气味区域7和19仅在DF组葡萄酒中检测到，而在葡萄汁中未检出，推测这些化合物可能是在酒精发酵过程中生成的。气味区域1、3、5和13在所有葡萄汁和葡萄酒样品中均稳定存在。

 

3.2.鉴定与气味区域相关的挥发性化合物

在GC-O-MS检测到的22个气味区域中，最终鉴定出12种化合物（表1）。所有样品中均检测到两种Strecker aldehydes：甲硫基丙醛（1）和苯乙醛（3）。这两种化合物常被报道为氧化型葡萄酒风味的贡献者，但在葡萄汁中的相关研究较少。在高温和氧气暴露条件下，白葡萄酒中蛋氨酸和苯丙氨酸在二羰基化合物存在时发生Strecker降解，分别生成对应的醛类，导致这两种化合物的含量升高。此外，检测到两个具有焦糖风味的气味区域，并通过GC-O-MS鉴定为呋喃酮（4）和高呋喃酮（5）。呋喃酮仅在DF组样品中检出，而高呋喃酮在所有样品中均有检出，但在DF组样品中的感知强度更高。

DF组样品中鉴定出四种内酯类化合物：阿比克酮（6）、γ-壬内酯（12）、γ-癸内酯（14）和马索亚内酯（22）。阿比克酮（6）具有强烈的咖喱香气，已在氧化型白葡萄酒中被检出。两种γ-内酯（12、14）具有桃子和干果香气，马索亚内酯（22）具有椰子和无花果风味。3-甲基-2,4-壬二酮（8、11）是具有西梅干和无花果风味的关键化合物，此前已在过早陈化的红葡萄酒中被报道，本研究中仅在DF组葡萄汁和葡萄酒中检出该化合物。

气味区域13被鉴定为β-大马酮，这是一种广泛存在、香气浓郁的类异戊二烯化合物，具有罐头苹果风味。尽管其风味描述与DF组样品相似，但该气味区域在对照组和DF组样品中均有检出，因此不具有区分性。（Z）-1,5-辛二烯-3-酮（20）具有天竺葵香气，此前已在DF组葡萄酒中被检出，近期研究表明该化合物是梅洛和赤霞珠葡萄汁中无花果干香气的关键成分，因此本研究将其纳入分析。

 

3.3.气味检测阈值

此前已在葡萄酒模拟液和葡萄酒中测定了具有干果香气的葡萄汁及葡萄酒有机萃取物中已鉴定化合物的检测阈值（Dth），但在葡萄汁模拟液中的相关数据较少。因此，本研究也在葡萄汁模拟液中测定了这些化合物的检测阈值（表2和表3）。如前所述，已有研究报道了呋喃酮和高呋喃酮在葡萄酒中的感官贡献，但对其检测阈值尚未形成明确共识。事实上，基于水-酒精溶液的乙醇浓度或pH值不同，检测阈值存在显著差异（表2）。此外，呋喃酮在20℃时的解离常数（pKa）为8.56，葡萄酒pH值的变化可能会改变其检测阈值。

 

 

在葡萄酒模拟液中，pH 3.5时呋喃酮和高呋喃酮的检测阈值分别为49.0 μg/L和26.5 μg/L，而pH 4.0时分别为46 μg/L和14.5 μg/L（表2）。在pH 3.5-4.0范围内，高呋喃酮的检测阈值降低了近一半，表明在较高pH值下其感官影响更显著。相反，呋喃酮的检测阈值保持稳定。在葡萄汁中，呋喃酮和高呋喃酮的检测阈值分别为10.5 μg/L和5.5 μg/L。呋喃酮和高呋喃酮的化学结构和感官描述极为相似，因此推测这两种化合物的混合物可能会使葡萄酒形成相似的风味特征。基于这一假设，Jarauta等（2006）通过缺失实验证实了呋喃酮和高呋喃酮之间存在协同作用。受该研究启发，本研究探究了亚阈值浓度的高呋喃酮对呋喃酮检测阈值的影响（表2）。结果显示，在水-酒精溶液中添加10 μg/L高呋喃酮，可使呋喃酮的检测阈值降低约10 μg/L，由此证实了这两种呋喃酮类化合物之间的协同作用。最后，这些发现表明，苹果酸-乳酸发酵在提高葡萄酒pH值的同时，可能会改变这些化合物的感官影响，增强葡萄酒的干果风味或焦糖风味。

 

3.4.葡萄汁和葡萄酒中的定量分析

通过定量分析验证了此前鉴定的挥发性化合物在具有干果香气的葡萄汁和葡萄酒中的感官影响，计算了它们的香气活性值（OAV，定量数据与检测阈值的比值），并讨论了其在多个有/无干果风味样品中的分布情况（表3）。

在葡萄酒模拟液中，pH 3.5时呋喃酮和高呋喃酮的检测阈值分别为49.0 μg/L和26.5 μg/L，而pH 4.0时分别为46 μg/L和14.5 μg/L（表2）。在pH 3.5-4.0范围内，高呋喃酮的检测阈值降低了近一半，表明在较高pH值下其感官影响更显著。相反，呋喃酮的检测阈值保持稳定。在葡萄汁中，呋喃酮和高呋喃酮的检测阈值分别为10.5 μg/L和5.5 μg/L。呋喃酮和高呋喃酮的化学结构和感官描述极为相似，因此推测这两种化合物的混合物可能会使葡萄酒形成相似的风味特征。基于这一假设，Jarauta等（2006）通过缺失实验证实了呋喃酮和高呋喃酮之间存在协同作用。受该研究启发，本研究探究了亚阈值浓度的高呋喃酮对呋喃酮检测阈值的影响（表2）。结果显示，在水-酒精溶液中添加10 μg/L高呋喃酮，可使呋喃酮的检测阈值降低约10 μg/L，由此证实了这两种呋喃酮类化合物之间的协同作用。最后，这些发现表明，苹果酸-乳酸发酵在提高葡萄酒pH值的同时，可能会改变这些化合物的感官影响，增强葡萄酒的干果风味或焦糖风味。

 

3.4.葡萄汁和葡萄酒中的定量分析

通过定量分析验证了此前鉴定的挥发性化合物在具有干果香气的葡萄汁和葡萄酒中的感官影响，计算了它们的香气活性值（OAV，定量数据与检测阈值的比值），并讨论了其在多个有/无干果风味样品中的分布情况（表3）。

 

 

Strecker醛类：葡萄汁样品中未检测到甲硫基丙醛，对照组葡萄酒中的平均含量为1.4 μg/L；对照组葡萄汁中苯乙醛的平均含量为9.2 μg/L，对照组葡萄酒中为5.9 μg/L。由于这两种化合物的含量均低于各自的检测阈值，因此它们不直接参与葡萄汁和年轻红葡萄酒的干果香气形成。

酮类：对照组和DF组样品中3-甲基-2,4-壬二酮（MND）的含量存在显著差异，具有干果风味的葡萄汁和葡萄酒中MND含量高于无干果风味的样品。结果显示，葡萄汁中MND的平均含量为68.1 ng/L，葡萄酒中为34.5 ng/L，表明该化合物对葡萄酒中的干果香气具有贡献作用。此外，葡萄酒中MND的含量低于葡萄汁，这一结果反映了酵母代谢对这种二酮类化合物的影响，推测可能是通过还原作用实现的。DF组葡萄汁中（Z）-1,5-辛二烯-3-酮的含量（92 ng/L）显著高于对照组，且远高于其检测阈值（0.0022 ng/L）。

内酯类：无论采用何种处理方式，葡萄汁中阿比克酮的含量均较低（<0.5 μg/L），且在葡萄酒中未检出。由于其含量低于检测阈值（0.9 μg/L），因此该化合物不参与样品干果香气的形成。具有干果香气的葡萄汁中γ-癸内酯含量高于对照组。此外，尽管γ-癸内酯的平均含量未超过0.4 μg/L，但略高于其检测阈值（0.3 μg/L），因此证实其对葡萄汁的干果香气具有感官贡献。葡萄酒中γ-癸内酯的平均含量为1.1 μg/L（高于其检测阈值0.7 μg/L），且与是否具有干果香气无关。具有干果香气的葡萄汁中马索亚内酯含量较高（高于检测阈值），但无论葡萄酒的香气特征如何，其在葡萄酒中的含量均较低。具有明显干果香气的葡萄汁样品中，γ-壬内酯的平均含量略高于对照组。相反，具有明显干果香气的葡萄酒中，γ-壬内酯的含量差异更为显著，对照组和DF组葡萄酒中γ-壬内酯的最高含量分别为13.9 μg/L和64.5 μg/L。

呋喃酮类；呋喃酮和高呋喃酮的定量结果显示，DF组样品中这两种化合物的含量显著高于对照组。酒精发酵过程中释放的呋喃酮和高呋喃酮含量分别达到179.1 μg/L和85.0 μg/L。最后，这些结果表明，呋喃酮和高呋喃酮对红葡萄汁和葡萄酒的干果香气具有重要贡献（OAV>1）。

 

3.5.添加气味化合物对红葡萄酒干果风味的感官影响

此前的结果证实了葡萄汁和葡萄酒中负责干果香气的化学家族具有芳香多样性。下一步需证实单个香气化合物（如具有茴香和果核风味的MND、具有焦糖风味的呋喃酮和高呋喃酮、具有熟桃子风味的γ-壬内酯）是呈现这些风味特征的红葡萄酒中的关键影响化合物。因此，本研究额外开展了一项实验，以验证这些化合物对红葡萄酒干果香气的感官贡献。向评审小组提供5个梅洛红葡萄酒样品，评估其干果香气强度。对照组葡萄酒无明显干果香气，且内酯类、呋喃酮类和MND的含量较低。以该葡萄酒为基底，分别单独或混合添加这些香气化合物，添加浓度与具有明显干果香气的红葡萄酒中的检出浓度一致。如图1所示，评审小组感知到不同葡萄酒样品的干果香气强度存在显著差异：向红葡萄酒中添加低浓度的MND或γ-壬内酯，未改变其干果风味强度。然而，与对照组相比，添加呋喃酮类化合物（C+FUR）显著改变了干果香气强度的感知。混合添加MND、γ-壬内酯、呋喃酮和高呋喃酮，显著增强了红葡萄酒的这种香气特征，由此证实了这些化合物对干果香气的协同贡献作用。

 

 

3.6.葡萄脱水期间光照对葡萄及葡萄酒香气化合物含量的影响

如补充材料表3所示，葡萄采后脱水显著改变了葡萄的理化参数，而光照的影响较小。因此，定量检测时需根据品种考虑稀释比例（表4）。研究表明，总体而言，葡萄采后脱水会提高葡萄汁和葡萄酒中所选干果香气标志物化合物的浓度。

结果显示，35%的脱水率会诱导烯醇酮类化合物的形成。此外，人工光照条件下脱水的葡萄中，高呋喃酮和呋喃酮的含量更高。无论葡萄品种如何，葡萄酒中这两种化合物的含量也呈现相同趋势，即光照处理组含量更高。对照组葡萄汁中未检测到γ-壬内酯。然而，在本实验的脱水条件下，光照脱水处理样品中该内酯的含量更高。同样，光照脱水处理也改变了葡萄酒中γ-壬内酯的浓度。

其他羰基化合物在对照组样品中均有检出，且不同处理会改变其在葡萄汁中的含量。梅洛葡萄汁中，光照脱水（D-L+）处理组的3-甲基-2,4-壬二酮（MND）含量升高，但无光照脱水葡萄酿造的葡萄汁中MND含量保持稳定；相反，赤霞珠葡萄脱水后，葡萄汁中MND含量系统性降低。葡萄酒中MND含量低于葡萄汁，且无论葡萄品种如何，脱水和光照处理对其含量均无影响。脱水处理对（Z）-1,5-辛二烯-3-酮的影响最为显著：对照组梅洛葡萄汁中该化合物含量较低（10.1 ng/L），而脱水葡萄酿造的葡萄汁中其含量超过250 ng/L；相反，光照处理未改变葡萄汁中该化合物的浓度。赤霞珠葡萄汁中得到类似结果，但浓度变化幅度小得多。

 

 

3.7.酒精发酵过程中3-甲基-2,4-壬二酮还原反应的检测

上述实验表明，葡萄汁中的两种关键影响化合物：3-甲基-2,4-壬二酮（MND）和（Z）-1,5-辛二烯-3-酮，在葡萄酒中的浓度系统性降低，即它们在酒精发酵过程中完全或部分降解。已知酿酒酵母（S.cerevisiae）代谢会将香气浓郁的（Z）-1,5-辛二烯-3-酮还原为香气微弱的（Z）-5-辛烯-3-酮。为评估酒精发酵过程中酿酒酵母对MND含量的影响，本研究向合成葡萄汁样品中添加或不添加MND，然后加入酿酒酵母（直接接种到模拟培养基中），并监测酒精发酵过程中MND的含量变化（图2）。静息酵母细胞孵育72小时后，MND含量显著降低；MND的消除与色谱图中两个峰的出现相关，推测这两个峰是具有酮醛官能团化合物的非对映异构体。本研究合成了该二酮的两种潜在还原产物：外消旋2-羟基-3-甲基壬-4-酮和4-羟基-3-甲基壬-2-酮，并由感官评审小组评估其气味特征，二者均具有茴香和类塑料气味（图2）。通过极性色谱柱对纯品进行气相色谱-嗅闻-质谱联用（GC-O-MS）分析，基于线性保留指数（LRI）和质谱数据，证实新鉴定的2-羟基-3-甲基壬-4-酮（极性柱LRI：1886–1893）存在于葡萄酒样品中。相反，葡萄酒样品中未检测到4-羟基-3-甲基壬-2-酮（极性柱LRI：1897–1914）。

采用极性色谱柱通过GC-O-MS分析稀释后的纯品样品，以确定2-羟基-3-甲基壬-4-酮各非对映异构体的气味描述：第一种具有类塑料气味，第二种香气更浓郁，兼具类塑料和茴香气味。酿酒酵母对β-二酮类化合物3-甲基-2,4-壬二酮的还原作用（伴随2-羟基-3-甲基壬-4-酮的生成），可能源于酵母产生的特定酶活性（酮还原酶）。

 

 

结论

 

总体结果表明，与干果风味相关的多种化学物质在梅洛和赤霞珠葡萄浆果中生成，并通过酒精发酵在葡萄酒中发生调控。次生代谢产物的生物合成与积累（这些产物可能赋予年轻红葡萄酒独特的化学和感官特性）也受光照触发，更广泛地说，受原位氧化机制调控。这些结果提醒我们，增加葡萄日照或诱导浆果脱水的种植方式，虽可能初步改善葡萄特性，但在某些情况下，从长期来看可能会调控或缩短红葡萄酒的货架期。

最后，与干果香气相关的化学标志物知识未来可作为一种新工具，更精准地研究葡萄园中的水分供应、光照（紫外线）和温度等胁迫因素对葡萄及葡萄酒感官品质的影响。