Food Chem：通过锦葵素-3-O-葡萄糖苷稳定作用筛选葡萄籽肽作为比色调节剂的新方法

通过锦葵素-3-O-葡萄糖苷稳定作用筛选葡萄籽肽作为比色调节剂的新方法

期刊：Food Chemistry（9.8）

发表日期：2024年10月

引言

 

花青素是一类水溶性酚类色素，其显色会受多种因素影响，可呈现红色、紫色或蓝色等不同色泽。花青素归属于黄酮类化合物，但其黄酮结构中核心C环的氧原子带有正电荷，形成的结构被称为黄烊盐环或黄烊盐阳离子。黄烊盐的共轭π键体系是其产生颜色的关键，该体系能缩小基态与激发态之间的能隙，使花青素可吸收可见光区域的低能量光子。而黄烊盐的共振结构能形成多种共振形式，进一步稳定该体系，同时也会对葡萄酒的实际呈色产生影响。

色泽是红葡萄酒的核心品质指标之一，其颜色主要来源于花青素，以及酿酒过程中花青素衍生形成的各类色素。红葡萄酒的呈色主要由五种游离花青素的单体3-O-单葡萄糖苷决定，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷。其中锦葵素-3-O-葡萄糖苷（Mv3g）是年轻红葡萄酒中含量最高的花青素，其浓度通常在300~500 mg/L之间。

花青素普遍存在稳定性差的问题，在葡萄酒体系中这一问题尤为突出，根源在于黄烊盐阳离子的不稳定性，这也导致花青素对光照、pH值、抗坏血酸、温度、糖类（酰化与非酰化）、氧气、二氧化硫或亚硫酸盐、酶、辅色剂以及金属离子等多种因素均十分敏感。

花青素与其他化合物的相互作用能提升其化学稳定性与比色稳定性，而辅色作用是目前研究最深入的黄烊盐阳离子稳定化机制之一。辅色作用贡献了年轻红葡萄酒中30%~50%的色泽，是维持其颜色稳定性的核心因素，因此该作用的研究具有极高的重要性。

辅色作用的本质，是有色花青素的芳香核与通常为无色的辅色剂之间，通过非共价疏水键发生的分子间相互作用。辅色剂与花青素的结合能对黄烊盐阳离子形成保护。目前研究最多的辅色剂为多酚类物质，近年来科研人员也发现了诸多具有潜力的新型辅色剂，包括金属离子、生物聚合物、蛋白质等。

葡萄酒酿造过程中产生的固体废弃物主要为葡萄皮渣和酒泥：葡萄皮渣主要由葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗组成，酒泥则是葡萄酒发酵、储存或过滤后，在酒桶中产生的酵母残渣。葡萄皮渣的产量约占加工葡萄总量的20%，而葡萄籽是其主要干基残渣，占葡萄酒固体废弃物总量的38%~52%。葡萄籽富含多酚、膳食纤维、多糖，同时含有大量谷氨酸和天冬氨酸，色氨酸与含硫氨基酸的含量则较低。利用酿酒副产物改善葡萄酒品质、研发色泽稳定化方法，仍是当前的研究热点。葡萄籽作为蛋白质和肽的天然来源，其在调控葡萄酒色泽稳定性等品质指标方面的技术功能价值极具开发潜力，且具备技术经济可行性。

蛋白质的结构和性质复杂，探究其与花青素的相互作用机制耗时费力，这也限制了蛋白质在花青素稳定化中的应用。而肽具有氨基酸序列短、构象柔性高、分子尺寸小的特点，部分肽还具备低分子量和良好的溶解性，能确保其在体系中保持溶解状态，因此肽成为极具吸引力的新型辅色剂候选物。目前，花青素-肽复合物的相互作用尚未得到充分研究。

计算化学方法的引入为解析花青素的稳定化机制提供了新的思路。分子对接是目前应用最广泛的计算方法之一，该技术能从分子层面揭示受体与配体的结合作用，清晰呈现二者的结合位点、结合能等核心信息。分子动力学模拟是另一项重要的计算化学手段，其以牛顿定律为基础，结合分子力学力场进行模拟分析，能全面揭示体系的物理和化学反应特性，被证实是研究花青素与蛋白质/肽相互作用的有效方法。

要阐明肽对花青素的作用机制，必须深入研究二者结合后的光学性质与色素呈色变化，而量子化学计算是探究这类性质的有效手段。含时密度泛函理论（TD-DFT）能精准解析体系的激发态特征，确定紫外-可见吸收带涉及的电子跃迁过程，同时实现可见光区域吸收光谱的模拟计算。基于可见光吸收光谱数据，结合三刺激值比色法可实现体系呈色的定量分析，因此三刺激值比色法的计算机模拟模型在理论上具备可行性，这也为葡萄酒色泽与外观的研究带来了重大创新。

本研究旨在探究葡萄酒中主要的花青素——锦葵素-3-O-葡萄糖苷，与葡萄籽粕酶解所得葡萄籽肽之间的相互作用。研究通过分子对接和分子动力学模拟，分析二者结合后肽与花青素的结构及构象变化；并借助量子化学计算，阐明葡萄籽肽作为锦葵素-3-O-葡萄糖苷辅色剂的作用机制及呈色变化规律。本研究结果有望从分子层面揭示葡萄籽肽与花青素的相互作用本质，为传统实验研究提供理论支撑，进一步完善二者相互作用的认知，同时为葡萄籽肽作为新型功能性葡萄酒色泽稳定剂的开发与应用奠定基础。

 

结果与讨论

 

3.1 肽的筛选

本研究对葡萄籽肽（GSP）的氨基酸序列进行筛选（表1），筛选依据为特定的序列特征要求。已有研究表明，甘氨酸（Gly）、谷氨酰胺（Gln）、苯丙氨酸（Phe）、天冬酰胺（Asn）和丝氨酸（Ser）这类氨基酸可与锦葵素-3-O-葡萄糖苷发生相互作用。此外，研究证实，部分氨基酸在肽序列的末端位点中发挥关键作用：谷氨酰胺、甘氨酸和谷氨酸主要分布在肽序列的N端，而精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸则主要存在于肽序列的C端，本研究的肽序列筛选也参考了这一特征。

 

 

3.2 肽的理化性质分析

已有系统综述指出，尽管肽的理化性质与其潜在活性之间的关联较为复杂，但已有多种实用工具可用于分析肽的行为特征与功能特性。表2展示了利用赛默飞肽分析工具得到的葡萄籽肽理化性质分析结果，本研究通过该工具获得了疏水性等多项关键参数，以深入解析肽的特性。疏水性是一项重要指标，具有疏水性倾向的肽会形成二级和三级结构，这一结构变化会减少肽残基与水的接触，进而影响其功能发挥。

 

 

本研究还获得了亲疏水性平均值（GRAVY），该指标与疏水性高度相关：数值为正则表明肽具有疏水性，数值为负则代表肽具有亲水性。除上述两项指标外，研究还测定了肽的等电点（pI），等电点会影响肽的溶解性，同时也会改变肽与其他分子的相互作用方式，进而对肽的三维结构产生影响。

基于肽的氨基酸残基特征及理化参数分析结果，本研究发现有五种肽（DAA-R、FIP-W、GSE-R、KEE-R和SQR-W）易发生副反应、氧化反应和片段化反应，这五种肽恰好是疏水性和亲疏水性平均值测定结果中数值最高的肽类。总体而言，表2中的各项理化参数初步揭示了葡萄籽肽残基的特征及其可能的理化行为。通过计算机虚拟筛选对肽进行活性评估，能够减少后续的实验测试次数，同时为肽的体外或体内活性验证提供更高效的研究方向。

 

3.3 分子对接分析葡萄籽肽-锦葵素-3-O-葡萄糖苷复合物的结合作用

本研究通过分子对接分析，确定了锦葵素-3-O-葡萄糖苷与葡萄籽肽结合后的结合区域、关键相互作用类型及结合能（kcal/mol）。所有分子对接实验均进行三次重复，仅筛选出无不利键的模型开展后续研究——不利键会产生排斥力，影响复合物的稳定性。同时，研究依据结合自由能的负值大小对不同对接构象进行排序，结合自由能负值越大，代表该复合物的结合状态越稳定。

表3列出了花青素与各肽结合后的结合能及相互作用类型，图1展示了锦葵素-3-O-葡萄糖苷与葡萄籽肽氨基酸残基最具代表性的分子对接二维作用图。结果显示，GGG-R（图1a）和FLG-W（图1b）的结合能绝对值显著高于其他肽段，而DAA-R（图1c）和KEE-R（图1d）的结合亲和力最弱。尽管KEE-R与花青素之间存在π-π堆积作用——该作用被认为是芳香族配体形成分子复合物的核心作用力，但肽分子并未完全包裹花青素，使其仍处于相对暴露的状态，这也是该复合物稳定性较差的原因。

 

 

 

花青素与肽结合形成最佳对接构象的过程中，锦葵素-3-O-葡萄糖苷的构象会发生改变。如图1所示，花青素分子中参与相互作用最活跃的两个基团为葡萄糖苷基和B环，二者会朝向肽分子完成结合作用。表3数据表明，花青素的A环和C环主要与肽分子发生疏水作用和π-π相互作用。

结合表2的肽理化性质参数来看，FDG-W、FLG-W、GGG-R和GSE-R这类疏水性指数和亲疏水性平均值均较低的肽，水溶性相对更高，这一特性会对其与配体的结合作用产生积极影响；当然，二者的结合还受受体结构、化学相容性等其他因素调控。

表3数据显示，除DAA-R、FDG-W和FIP-W三种肽外，锦葵素-3-O-葡萄糖苷与其余所有肽的结合均有谷氨酸参与，是参与相互作用最多的氨基酸之一，与苯丙氨酸的参与次数持平。值得注意的是，苯丙氨酸未参与DAA-R、FLG-W和GSE-R三种肽与花青素的结合；组氨酸是唯一仅参与一次相互作用的氨基酸残基，精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸等氨基酸也仅参与两次结合作用。

二者的结合作用以范德华力为主，范德华力与氢键共同构成辅色作用的结合力核心。所有肽与花青素的结合均存在常规氢键（FDF-R除外），也均存在碳氢键（FIP-W除外）；烷基/π-烷基相互作用是第二大主要作用类型，仅在FIP-W和GSE-R的结合过程中未发现该作用。

表3数据表明，花青素B环与肽的芳香族残基之间存在堆积作用，FLG-W（图1b）、FIP-W和KEE-R的结合均体现了这一特征。辅色复合物通过分子堆叠聚集形成，其稳定性主要依靠花青素有色形式的可极化平面核与芳香族残基之间的疏水作用维持。同时本研究还发现，DAA-R、FDG-W、FLG-W、GGG-R和GQN-W这类与糖残基相连的芳香族基团，能形成更稳定的辅色复合物。GQN-W与锦葵素-3-O-葡萄糖苷之间存在T型堆叠作用，研究表明，该作用由静电作用驱动——静电势是T型堆叠形成的关键因素，其静电作用能调控分子间的结合位点与作用方式，进而促进辅色作用的发生。

研究结果显示，白葡萄来源的葡萄籽肽结合能分布更均一，红葡萄来源的葡萄籽肽结合能差异则相对更大；但单因素方差分析结果表明，两种葡萄来源的葡萄籽肽结合能差异无统计学意义（p>0.05）。不过从二者的相互作用特征来看，仍存在一个显著规律：辅色剂中的羟基数量越多，与花青素形成的复合物稳定性越强。例如含有三个羟基的GGG-R，其与花青素的结合能绝对值在所有肽段中最高（表3）。

 

3.4 分子动力学模拟解析锦葵素-3-O-葡萄糖苷与葡萄籽肽结合的作用效应

3.4.1 葡萄籽肽的结构分析

所有受试葡萄籽肽均呈现出相似的二级结构特征，主体为螺旋结构，两端带有卷曲结构，无折叠链结构；其中FDG-W是唯一仅存在卷曲结构的肽段。本研究通过计算均方根偏差（RMSD）和回转半径（Rg），分析了各葡萄籽肽在溶液中单独存在时的结构稳定性与折叠状态（见图2）。整体来看，各肽段在模拟过程中均发生了构象变化，空间结构整体紧凑，但其分子轴会出现周期性的伸舒变化；从均方根偏差参数分析，各肽段的结构整体相对稳定，仅存在偶尔的波动。

 

 

3.4.2 肽-花青素体系的构象转变与稳定性变化

辅色复合物在水中的形成效果最为显著，在极性溶剂中也易形成，因此本研究以水为溶剂开展分子动力学模拟，分析各复合物的结构稳定性与构象特征。模拟结果验证了此前分子对接实验的部分发现，例如锦葵素-3-O-葡萄糖苷的A环和C环参与相互作用的特征（见图3）。

 

 

如图2a所示，受试肽与配体结合形成复合物后，均方根偏差值更低，说明复合物的结构稳定性更高。尽管FDG-W和GGG-R的结合能绝对值较高（见表3），但其均方根偏差呈现出较明显的波动（见图2b）。这一现象可通过受体与配体间存在的强有利关键相互作用解释：常规氢键对复合物的形成和稳定起到了重要作用，烷基/π-烷基相互作用也产生了相同的稳定效应；尤其是GGG-R，其与花青素间存在两处π-阴离子静电相互作用，这类相互作用的结合力极强。此外，复合物的两个组成部分均具有高度的构象柔性，可形成多种构象，这也是其均方根偏差出现波动的原因之一。

本研究分别对单独的肽、肽-花青素复合物进行分子动力学模拟采样，清晰呈现了模拟周期内，锦葵素-3-O-葡萄糖苷结合至肽的活性结合区域后，复合物的分子运动、结构偏差与构象变化特征。分子动力学模拟是对接实验后极具价值的验证手段，模拟得到的复合物轨迹相对稳定，这一结果也证实了配体与受体的对接结合并非弱结合，若为弱结合则无法观测到稳定的轨迹特征。

 

3.5 紫外-可见光谱测定

辅色剂对花青素的稳定化发挥关键作用，其会显著改变结合态花青素的分子构型，进而影响整个体系的光学性质。本研究选取与肽结合亲和力最佳的构象，分析分子对接后花青素的构型变化，并基于该构象开展含时密度泛函理论计算，确定分子轨道能级，进而计算出电子跃迁能，以此绘制体系的理论紫外-可见光谱。

采用杂化泛函B3LYP/6-31++g(d,p)在软件中进行含时密度泛函理论计算，得到了第一激发单线态的垂直跃迁能，借此可检测到花青素的吸收带及最大激发能（见图S2）。有研究表明，该吸收带对应着可见光区域振荡强度最高的吸收峰。花青素色素会发生可逆的结构变化，且不同结构对应的吸光度存在差异。

 

 

本研究中，与各肽结合后的锦葵素-3-O-葡萄糖苷构象对应的光谱，其摩尔吸光系数均出现下降；唯有与GQN-W结合的锦葵素-3-O-葡萄糖苷，其光谱对应的最大吸收波长相较于游离态锦葵素-3-O-葡萄糖苷发生蓝移，且呈现出轻微的增色效应（见图S2），而增色效应也是辅色作用中常见的现象。

本研究用于计算光谱的杂化泛函，所模拟出的光谱与黄烊盐阳离子形式的锦葵素-3-O-葡萄糖苷的实验紫外-可见光谱高度吻合，由此可清晰解析出导致花青素颜色改变的电子跃迁过程。实验中研究辅色作用时，通常会考虑pH值以及色素和辅色剂的浓度等因素，因此本研究的光谱测定结果仅为理论推测，旨在初步探究肽作为花青素辅色剂在稳定化方面的潜在作用。

 

3.6 计算机模拟比色分析

表4列出了锦葵素-3-O-葡萄糖苷与各受试肽对接形成不同构象后，通过三刺激值比色法计算得到的CIELAB色彩参数。本研究将这些构象的色彩参数与空白样品，以及无扭转的黄烊盐阳离子形式锦葵素-3-O-葡萄糖苷三维结构的色彩参数进行对比。计算得出游离态锦葵素-3-O-葡萄糖苷的色彩参数对应的呈色为红色调，与黄烊盐阳离子在酸性条件下的实际呈色一致。整体而言，所有肽与锦葵素-3-O-葡萄糖苷的相互作用均降低了游离态花青素的颜色强度，且不同肽造成的影响存在差异，具体表现为明度普遍升高、彩度普遍降低。此外，肽的葡萄来源与颜色变化趋势之间未发现明显关联。其中，GGG-R肽引发的色差值最小，而GQN-W肽造成的色差最大，达62.5个CIELAB单位，也是唯一一种使体系彩度高于游离态锦葵素-3-O-葡萄糖苷的肽，相关分析见下文。

 

 

分子对接和分子动力学模拟的结果均显示，锦葵素-3-O-葡萄糖苷与不同肽结合时会形成不同构象（图3为其中一组分子动力学模拟结果）。尽管花青素为平面分子，但其C环与B环之间的键旋转不仅会改变体系的光谱特征，进而导致比色参数变化，还会促使构象异构体形成。研究表明，生色团的分子几何结构对最终呈色具有显著影响。同时，花青素与部分肽结合时，苷元发生的扭转等构象变化，也可能会影响黄烊盐阳离子的相互作用。糖苷取代基会通过拉伸、扭转或弯曲的方式调整结构以实现与肽的结合，这一过程会改变C环内的电子分布（π电子、σ电子和n电子），进而改变分子的极性、构型、相互作用方式及芳香族π电子的空间位阻。

图4展示了锦葵素-3-O-葡萄糖苷与各受试肽结合后的比色变化特征。总体而言，所有复合物的呈色均与游离态花青素存在差异，其中白葡萄皮渣来源的肽引发的色差略大。这类色差主要由明度整体升高、色相改变及彩度降低共同导致，即体系的颜色饱和度出现普遍性下降，这一点在与白色参比样的色差对比中也可得到印证。DAA-R、GSE-R、FDF-R、FIP-W和FLG-W几乎完全消去了花青素的呈色；但GGG-R、FDG-W和GQN-W并未表现出这一整体规律，其中GQN-W与花青素结合后，体系彩度提升了22.7个CIELAB单位。另一显著特征为，与花青素结合能最高的GGG-R肽，对花青素呈色的改变程度最小。理想的辅色剂应具备较高的稳定化能，且对花青素原有呈色的改变尽可能小，因此肽与花青素结合后需尽可能保留其光谱特征。由此可见，GGG-R和FDG-W与锦葵素-3-O-葡萄糖苷相互作用时引发的轻微颜色变化，可能与二者的相互作用方式（图1）及分子动力学模拟中观察到的复合物构象柔性相关（图2a）。

 

 

从光谱学角度来看，本研究将锦葵素-3-O-葡萄糖苷从各对应肽的复合物中分离后进行光谱分析，在计算资源利用方面实现了高效性，且取得了良好的分析结果。但值得注意的是，若考虑完整的复合物体系进行分析，能获得更精准、详尽的光谱信息。这是因为辅色作用中所需的π-π相互作用（如FLG-W参与的π-π相互作用，见表3），若不考虑完整复合物体系，其作用特征可能无法被完整解析。

 

结论

 

葡萄酒基质体系复杂，要阐释其呈色机制，核心是探究其中花青素的物理与化学行为特征。本研究将计算化学、分子建模与分子动力学模拟相结合，可作为筛选潜在辅色剂化合物的基准方法，同时通过精准分析，能够阐释花青素的紫外-可见光谱性质，以及其分子间相互作用、光吸收特性相关的各类现象。在本研究中，色素分子的几何构型是关键研究对象，但需强调的是，从比色分析的角度出发，肽类分子也应纳入研究范畴，因其与花青素形成的复合构象，才能真实反映其对体系光学性质的实际影响。

本研究采用的研究方法在分析准确性与计算效率方面均表现良好，但要筛选出最优辅色剂，还需采用耗时更长的研究手段，纳入更多影响参数开展分析。此外，通过对葡萄籽肽的深入研究，明确其整体的相互作用模式及各氨基酸残基的作用特征，能够为后续实验研究提供指导，进而优化并实现葡萄籽粕等酿酒副产物的定向水解工艺，获得更多种类的活性肽；而借助计算机虚拟筛选技术获得的前期研究数据，也能为通过肽类提升色素颜色稳定性的研究提供支撑。