TRENDS GENET：葡萄野生资源基因组学中的研究

葡萄野生资源基因组学中的研究

期刊：Trends in genetics（16.3）

发表日期：2024年05月

野生葡萄类群具有极为丰富的遗传多样性，是诸多关键农艺性状的重要基因资源，对提升葡萄栽培体系的气候适应能力与可持续发展水平具有不可替代的作用。本文综述了野生葡萄物种在基因组组装与解析领域的最新突破，及其如何推动葡萄演化研究取得全新认知，内容涵盖野生物种对环境胁迫的适应性机制、葡萄驯化历程等核心科学问题。系统阐述了基于野生葡萄的二倍体染色体水平基因组，如何高效推动抗病候选基因与花性别决定关键基因的挖掘，并助力完成首个葡萄图式泛基因组的构建。最后，从数据共享体系构建、功能基因组学工具开发及遗传育种效率提升等方面，探讨了野生葡萄基因组学对葡萄科学研究与产业栽培的深远影响。

葡萄作为全球经济价值最高的多年生园艺作物之一，其农场端经济规模预估可达6000亿美元，广泛种植于世界各地，主要用于葡萄酒酿造、鲜食、制干及果汁加工等。栽培葡萄Vitis vinifera约在8000年前由其野生祖先Vitis vinifera ssp.sylvestris（下文简称V.v.sylvestris）经多次独立驯化而来，在此之前人类对野生葡萄的采集利用历史已超过12000年。目前全球V.v.vinifera栽培品种已逾6000个，部分品种起源可追溯至数百年乃至数千年前，罗马时期考古遗址的古DNA分析亦为此提供了直接证据。尽管赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、霞多丽（Chardonnay）等少数品种在加州、智利、新西兰、南非及澳大利亚等新兴葡萄酒产区占据生产主导地位，但各地传统栽培的V.v.vinifera品种仍蕴含广泛的遗传变异。该多样性体现在成熟期、香气特征、果穗结构、果实大小等表型性状，以及抗旱、抗寒等气候适应性方面存在显著差异。即便如此，近两个世纪以来，葡萄产业应对各类生物与非生物胁迫仍高度依赖野生葡萄资源。野生葡萄虽不适宜直接用于果实生产与酿酒，却凭借对环境胁迫与病虫害的优异抗性，成为葡萄遗传改良的核心种质基础。

葡萄属（Vitis）约在1010万～4510万年前完成分化，是植物界中起源最为古老的属之一，其祖先类群起源于北美，并于晚始新世扩散至欧亚大陆。现有针对葡萄属系统发育的研究结果存在一定分歧，而近期全基因组测序数据有效厘清了6个北美类群的演化关系，证实尽管存在网状进化与适应性基因渗入等复杂演化历史，葡萄属物种间的系统发育关系仍可通过基因组数据实现精准解析。

葡萄属物种主要分布于北半球温带区域，在北美与亚洲地区尤为集中（图1A）。北美野生葡萄物种的遗传与表型多样性尤为突出，与其大陆内部复杂多样的气候、土壤及生态环境格局密切相关（图1B），使其能够适应从东南部湿润气候、西南部干旱炎热环境至北部寒冷区域的多样生境。同时，北美野生葡萄亦是抗病品种选育与抗性砧木培育的关键基因供体。自19世纪60年代法国根瘤蚜危机期间，部分野生物种首次被用作V.v.vinifera的嫁接砧木以来，其应用范围已逐步拓展至砧木与接穗协同育种。例如，河岸葡萄（Vitis riparia）衍生砧木可促进果实早熟，并在肥沃土壤中调控接穗长势；冬葡萄（Vitis berlandieri）则在石灰性土壤与干旱环境下表现优异。圆叶葡萄（Muscadinia rotundifolia）、亚利桑那葡萄（Vitis arizonica）等物种对霜霉病、白粉病、皮尔斯病等重大病害具有稳定遗传抗性，是现代抗病育种的核心亲本材料。气候变化研究共识表明，至2070年全球现有葡萄园24%～73%的种植区域或将不再适宜葡萄栽培，因此，基于野生葡萄资源挖掘并导入适应性性状，对保障葡萄产业的存续与可持续发展至关重要。

鉴于野生葡萄在葡萄产业中的核心地位，近年来研究人员依托DNA测序技术与组装算法的革新，系统性开展了野生葡萄基因组资源开发工作。葡萄基因组学发展长期受限于基因组结构复杂性，尽管葡萄基因组大小约500 Mb，与杨树（465 Mb）、苜蓿（500 Mb）、水稻（430 Mb）等物种相近，但其高度杂合特性极大增加了测序与组装难度。包括栽培葡萄祖先V.v.sylvestris在内的野生葡萄均为雌雄异株且专性异交，种群杂合度水平极高。传统k-mer频率分析与SNP检测显示其基因组杂合度约1%～1.5%，但该类方法显著低估了单倍型间真实的多态性水平。研究证实，同源染色体间存在缺失、插入、倒位等结构变异，导致不同葡萄物种单倍型基因组大小平均差异约20%，并形成显著的半合子效应，约5%的基因仅存在于单一单倍型中。此类半合子特性，尤其在性别决定区（SDR），会造成基于共有序列拼装的基因区域注释不完整。

长读长测序技术与可实现杂合分型的单倍型组装算法问世，标志着野生葡萄基因组学研究正式步入新阶段。近5年间已有45个野生葡萄基因组公开，包括6个V.v.sylvestris、28个葡萄属物种（24个北美种、4个亚洲种）、8个种间杂交材料及3个圆叶葡萄基因组（图2A，附表1），其中17个为二倍体染色体水平组装，涵盖近期完成的9个北美纯种物种（图2B）。FALCON-Unzip等组装工具对该领域快速发展起到关键推动作用，尽管基于HiFi读长的新型工具逐步替代传统软件，但现阶段已发表的多数野生葡萄基因组仍采用该软件完成组装与分型。FALCON-Unzip依托长读长识别杂合SNP位点并依据等位基因型完成序列分群，成功构建代表不同单倍型的连续序列，避免了传统共有序列拼接造成的遗传信息丢失。结合遗传连锁图谱、光学图谱与Hi-C技术，单倍型组装结果可进一步挂载至染色体水平，为解析葡萄驯化、野生资源胁迫适应性等复杂性状提供了高精度基因组基础。

驯化葡萄V.v.vinifera与其野生祖先V.v.sylvestris在表型上存在显著分化，主要表现为果实含糖量提升、果穗与浆果增大，以及繁育系统由雌雄异株转变为雌雄同株。遗传学与考古学证据表明，葡萄是人类最早驯化的多年生作物，驯化发生于约8000年前，远早于多数多年生作物约2000年前的驯化时间。全基因组重测序群体分析显示，葡萄有效种群大小（N_e）自约20000年前持续下降，仅在约8000年前经历轻度瓶颈效应，提示人类与野生葡萄的互动历史长达12000年，早期采集行为逐步筛选特定V.v.sylvestris基因型，使其遗传基础在驯化前持续收窄。基于V.v.sylvestris全基因组重测序数据，可在全基因组水平对比野生与栽培群体的遗传多样性，精准定位栽培葡萄中多样性显著降低的基因组区域，揭示驯化过程中自然选择与人工选择的作用靶点。研究发现，受选择区域包含多个与果实发育相关的基因，参与果实软化、糖分转运与原花青素积累等关键过程。葡萄驯化是单次起源还是多次独立发生，长期存在争议，主要原因在于新石器时代V.v.sylvestris分布范围极广，横跨中亚至伊比利亚半岛、克里米亚至北非西北部。近期大规模全基因组重测序研究为该问题提供了关键证据，通过对16个国家1604份V.v.vinifera与844份V.v.sylvestris材料进行分析，并结合染色体水平V.v.sylvestris单倍型参考基因组，证实葡萄在约11000年前于西亚与高加索地区发生两次同步驯化事件，分别推动了鲜食葡萄与酿酒葡萄的演化。

全基因组测序不仅推动葡萄驯化研究取得突破性进展，依托野生葡萄二倍体参考基因组，对驯化过程中关键性状选择的解析亦实现重大突破，其中花性别决定遗传基础及其驯化过程中由雌雄异株向雌雄同株转变的机制解析尤为突出。除栽培葡萄V.v.vinifera外，包括V.v.sylvestris在内的所有葡萄属物种均为雌雄异株。葡萄性别决定遵循双位点遗传模型，两个紧密连锁位点分别控制雌雄器官的育性，形成雌性（F）、雄性（M）与雌雄同株（H）三种性别决定区（SDR）单倍型，对应雄性（MF杂合）、雌性（FF纯合）与雌雄同株（HF杂合或HH纯合）三种基因型。

性别决定区早在21世纪初即被初步定位，但受限于单一共有参考基因组PM40024，不同SDR单倍型的精细注释难以实现。2019年，雌雄同株品种赤霞珠（HF）与霞多丽（HH）的SDR单倍型被成功分型，证实PM40024的SDR序列为F与H单倍型的嵌合拼接，并揭示不同单倍型间存在基因组成差异，但当时缺乏M单倍型数据导致性别决定基因无法鉴定。2020年首批V.v.sylvestris基因组发布后，雄性M单倍型的结构与基因组成得以系统解析。尽管不同研究对SDR边界划分存在差异，后续对欧洲、北美、东亚556份葡萄材料全基因组测序数据的整合分析，最终确定了葡萄属内高度保守的SDR边界。对V.v.vinifera、V.v.sylvestris及V.arizonica二倍体组装的20个完整SDR单倍型分析，分别筛选出1275个F型特异SNP与270个M型特异SNP，其中影响蛋白序列与转录因子结合位点的关键变异，最终锁定两个性别决定候选基因：INAPERTURATE POLLEN1（VviINP1）为雄性育性关键基因，VviYABBY3为雌性发育抑制因子。雌性葡萄花中VviINP1存在纯合8 bp有害缺失，结合其在拟南芥、玉米、水稻等物种中的同源基因功能，以及雌性葡萄花粉无萌发孔且不育的表型，证实VviINP1参与花粉萌发孔形成与雄性育性调控。VviYABBY3存在两个雄性特异SNP，且在雄花中表达量显著上调，其雄性优势等位基因可能抑制雄花中雌蕊伸长与柱头发育。尽管VviINP1与VviYABBY3为性别决定核心候选基因，其具体分子功能仍需功能验证实验进一步证实。性别连锁多态性分析显示，栽培葡萄中存在两次独立重组事件形成雌雄同株H1与H2单倍型，其中H1在鲜食与酿酒葡萄中均有分布，H2主要存在于伊比利亚半岛与西欧酿酒葡萄中。后续研究还发现H3、H4、H5三种次要重组单倍型，表明H2单倍型由两次连续重组事件产生。

野生葡萄是白粉病、霜霉病、皮尔斯病等葡萄重大病害抗性基因的核心供体。传统数量性状位点（QTL）定位已挖掘大量抗病相关基因组区域，遗传作图与分子标记开发为抗病位点染色体定位与标记辅助育种体系构建奠定了基础。然而，迄今仅通过精细作图与BAC文库步移法，从圆叶葡萄G52的Run1位点克隆得到一个抗白粉病R基因。缺乏抗病材料的高质量基因组组装，极大限制了抗病QTL位点的关键基因克隆，不仅阻碍葡萄抗病分子机制解析，也难以开发功能完美分子标记，导致抗病育种中野生供体染色体片段产生数十Mb的连锁累赘。

近两年来，抗病野生葡萄二倍体基因组与单倍型分型技术的突破，推动抗病位点解析与候选基因挖掘进入新阶段，已系统解析两个抗白粉病位点（Run1.2、Run2.2）、两个抗霜霉病位点（Rpv12、Rpv33）及一个抗皮尔斯病位点（PdR1）。依托已知抗病连锁标记，可在抗病材料二倍体基因组中精准定位目标单倍型（图3）。受限于葡萄遗传群体规模偏小，初始定位的目标区间（ROI）通常达数Mb，可通过加密标记密度实现精细定位。例如，利用rhAmpSeq标记重组断点分析与关键重组体浅层全基因组测序，将Rpv33区间由8 Mb缩小至0.46 Mb。抗病位点的候选基因挖掘依赖完整单倍型组装与准确分型，而目标区域富含重复序列与重复基因，若无额外遗传证据难以仅通过生物信息学完成解析。研究人员采用亲本基因组短读长对长读长进行分型分箱、rhAmpSeq与skim-seq标记辅助分型、回交后代单倍型重测序等策略，分别完成Rpv12、Rpv33与Run1.2的单倍型解析。通过抗性与感性单倍型序列比对，可鉴定抗性特异基因与等位变异，该过程高度依赖蛋白质编码基因结构的精准注释，研究发现高达65%的抗病基因模型需人工校正优化。结合等位基因特异性表达数据，最终筛选获得14个抗病候选基因，包括4个PdR1相关胞外受体（2个类受体蛋白、2个类受体激酶）与9个分布于霜霉病、白粉病位点的胞内NLR类受体。值得注意的是，圆叶葡萄G52中Run1位点的抗白粉病基因并未出现在圆叶葡萄Trayshed的Run1.2单倍型中，提示不同抗病单倍型可能由不同抗性基因或等位变异独立调控。

尽管葡萄基因组资源日益丰富，现有研究仍普遍依赖单一参考基因组，而比较基因组学证实结构变异（SV）是影响农艺性状的重要遗传因子。结构变异可发生于多个层级：（i）同一基因型的等位基因水平；（ii）无性系克隆水平；（iii）物种内自然群体个体间；（iv）不同物种间（图4A–C）。为全面覆盖多层级结构变异，无参考依赖的图式基因组构建策略应运而生，推动泛基因组学在作物研究领域快速应用。

葡萄泛基因组学研究起步较晚，但现有成果已展现出巨大应用潜力。首个葡萄图式泛基因组基于9个北美分支葡萄属物种的单倍型基因组进行全两两比对构建。序列水平分析显示，约一半基因组序列为所有物种共享，包含超过三分之二的核心基因（每个二倍体基因组约40000个）；其余变异序列富含Gypsy类转座元件，且在基因座周边分布密集。可变基因集（特有基因与可缺失基因）具有转录本更短、表达量更低、非同义/同义替换率更高、快速进化基因家族富集等特征，被认为在局部适应性演化中发挥核心作用。此外，可缺失基因数量预计在约20000个时趋于饱和，而可缺失基因组序列则呈开放状态。图式泛基因组可高效映射自然群体短读长数据，实现多物种同步比对与精准定位，在泛基因组全基因组关联分析（pan-GWAS）中成功挖掘与野生葡萄耐盐性相关的阳离子转运蛋白基因。

葡萄图式泛基因组（图4D）并非静态的最终组装产物，而是动态更新的研究框架。自然群体测序数据可将新变异整合至图式结构中（图4E），同一物种的多个基因组可用于构建物种水平泛基因组，全面捕获种内变异，这对品种与克隆多样性极高的葡萄尤为重要。整合野生与栽培材料的泛基因组可为驯化研究提供全新视角，已有泛基因组研究将材料分为V.v.vinifera栽培品种、V.v.sylvestris野生祖先及其他野生葡萄三类，发现基因家族存在显著的获得与丢失事件，且与农艺性状及胁迫抗性密切相关。泛基因组学可充分利用二倍体基因组信息，系统捕获种内与种间结构变异，除pan-GWAS外，还将推动泛转录组学等多组学研究，尤其适用于存在高频基因渗入的杂交材料与野生葡萄群体解析。

野生葡萄基因组学的快速发展极大推动了葡萄科学研究与遗传改良。随着长读长测序成本下降与HiFi读长支撑的端粒至端粒组装技术成熟，未来针对野生葡萄性状遗传基础解析与候选基因挖掘的研究，均可依托项目特异性基因组或泛基因组参考开展。尽管DNA测序已不再成为技术瓶颈，葡萄遗传作图群体规模偏小（约150个单株）导致定位分辨率偏低，大量候选基因仍需功能验证。构建具有更高重组频率的大群体将显著提升遗传分析精度，自动化高通量表型平台则可为大规模群体精准表型鉴定提供支撑。

候选基因功能鉴定依赖目标生理或病理条件下的精准表达检测，而参与关键生物学过程的细胞数量通常极少，导致全组织测序信号稀释，难以捕获核心响应基因。例如白粉病侵染过程中，仅单个表皮细胞与真菌结构互作并启动早期免疫反应，全叶片RNA-seq会掩盖关键信号。单细胞测序与空间转录组技术尚未应用于葡萄研究，但其有望在细胞与空间水平解析基因表达动态，为精准定位野生葡萄优异性状关键基因提供全新技术路径。

葡萄功能基因组学研究长期受限于转基因技术瓶颈，遗传转化效率偏低、基因型依赖性强及培育周期长等问题突出，且缺乏适用于多种野生葡萄的转化体系，严重制约非V.v.vinifera背景下候选基因功能验证（见“亟待解决的问题”）。近期研究实现了基于胚性愈伤原生质体的多葡萄基因型再生体系，培育周期可缩短至6个月，并成功应用质粒DNA与RNP复合物介导的基因组编辑。此外，高效稳定转化体系的构建依赖染色质动态调控机制解析，而葡萄表观遗传与三维基因组研究仍极为薄弱。基于Hi-C、ATAC-seq与ChIP-seq的黑比诺染色质开放状态分析证实，增强子染色质状态与基因表达密切相关。构建葡萄属物种染色质与表达图谱，将深化基因组功能与演化机制认知，为CRISPR/Cas9靶向整合等高效基因组编辑技术提供理论基础。

海量基因组数据的产出对数据整合与标准化提出更高要求。自2007年首个葡萄参考基因组发布以来，研究共同体始终致力于推动基因组数据共享开放。尽管基因命名标准化持续推进，基因结构注释方法不统一仍导致不同研究间基因对比存在障碍。随着新型基因组资源快速积累，构建标准化、系统化的数据平台愈发迫切。Grapecea平台整合了国际葡萄研究界数十年成果，为PM40024等基因组提供统一命名体系，支持人工curated基因目录浏览与新基因提交，并通过Gene Cards工具实现基因功能与组织特异性表达数据关联，其注释系统可兼容包括端粒至端粒基因组在内的多版本组装。Grapegenomics.com则聚焦葡萄属野生资源，提供标准化基因组访问与高级数据分析工具，截至2024年3月23日已收录48个基因组（26个V.v.vinifera、4个V.v.sylvestris、13个野生种、5个种间杂种），依托JBrowse2实现跨基因组共线性分析。Gramene数据库构建了包含38个基因组（10个野生葡萄）、1288848个基因的泛基因集，支持跨物种比较基因组学分析，可通过基因树、多序列比对、表达数据与代谢通路整合实现基因功能深度挖掘。尽管现有平台取得显著进展，仍缺乏统一集成的数据库系统整合分散的测序项目。构建中心化与联合式数据资源，将极大提升现有基因组数据的可访问性与管理效率，优化未来研究协同性。随着领域持续发展，二倍体基因组与图式泛基因组的广泛应用，将为核心/可变基因组解析与泛转录组数据可视化提供全新研究范式。