Molecules：香气物质、酚类化合物与口腔组分的相互作用及其对葡萄酒香气挥发性的影响

香气物质、酚类化合物与口腔组分的相互作用及其对葡萄酒香气挥发性的影响

期刊：Molecules（5.1）

发表日期：2020年4月

 

 

研究摘要

 

为探究口腔生理环境对葡萄酒典型香气物质挥发性的作用，本研究配制人工葡萄酒体系，并分别添加三类口腔组分：离心人唾液（HS）、含黏蛋白人工唾液（AS）、颊上皮细胞（BC）。每组葡萄酒体系中单独添加四种葡萄酒特征香气物质（愈创木酚、β-苯乙醇、己酸乙酯、β-紫罗兰酮），考察四种酚类物质（没食子酸、儿茶素、葡萄籽提取物、红葡萄酒提取物）对香气挥发性的影响。采用平衡态静态顶空结合固相微萃取-气相色谱质谱联用（SPME-GC/MS）技术完成检测。结果表明，所有口腔组分均会显著改变四种香气物质的挥发水平，无论香气分子极性如何，添加颊上皮细胞的葡萄酒体系整体香气挥发性更高。对比含人工唾液的体系，人唾液体系中愈创木酚、己酸乙酯挥发性显著降低，而β-紫罗兰酮呈现相反规律，该差异分别与唾液酶代谢、黏蛋白吸附滞留效应有关。酚类物质对香气挥发性的调控作用随酚种类、香气分子性质存在明显差异。没食子酸对极性香气物质几乎无影响，但可提升疏水性最强的己酸乙酯、β-紫罗兰酮的挥发能力，类黄酮多酚整体会降低极性香气（愈创木酚、β-苯乙醇）与含人唾液、颊上皮细胞体系中疏水性β-紫罗兰酮的挥发性，二者作用机制不同，对极性香气主要依靠π-π堆叠作用，对非极性香气则以疏水结合为主。与之相反，类黄酮多酚会促进己酸乙酯挥发，推测原因是多酚可抑制唾液中羧酸酯酶等代谢酶活性，减少该香气物质的分解损耗。

 

研究背景

 

香气挥发性物质若要被人体感知，必须从葡萄酒基质释放至气流中。气流中的香气释放量取决于气相中挥发性物质的含量，以及所有影响香气在气-液两相分配平衡的各类因素。香气物质自身理化特性、葡萄酒基质化学组成均会调控香气分子与葡萄酒基质组分的结合程度。现有葡萄酒-香气相互作用相关研究，大多仅考察单一基质组分（多酚、多糖等）的影响，或是采用配方更复杂的人工葡萄酒、重构葡萄酒体系开展多组分探究。

当葡萄酒进入口腔后，体系内挥发性、非挥发性组分还会与唾液、口腔黏膜等口腔结构发生相互作用，进而改变香气挥发特性，但目前这类相互作用背后的分子机理尚不清晰。现有探究唾液对葡萄酒香气释放影响的研究，采用的检测手段（静态/动态顶空）、葡萄酒基质（人工酒/真实酒）、待测香气（单一香气/混合香气、原酒挥发性组分）、唾液前处理（离心/未离心）均不统一，难以归纳唾液-葡萄酒-香气三者相互作用的统一规律。

此外，现有基于风味水溶液的研究发现，除熟知的稀释效应、盐析效应外，唾液可通过多重途径作用于香气分子，如依靠氢键、疏水作用结合不同香气物质，或借助唾液酶对香气进行代谢分解，部分代谢产物同样具备香气活性，但上述效应在葡萄酒体系中是否同样存在，葡萄酒基质中的酚类物质能否调控唾液与香气的相互作用，仍有待验证。目前，其他口腔生理组分对香气挥发性的影响尚未见系统报道。已有研究证实葡萄酒香气可吸附于口腔黏膜，但香气能否直接结合颊上皮细胞，或是先吸附于黏膜表面多酚再与香气结合仍不明确，且尚无研究同步考察唾液与颊上皮细胞共同对葡萄酒香气挥发产生的综合影响。

 

材料与方法

 

2.1.化学品与试剂

 

2.2.模拟葡萄酒

模拟葡萄酒：10% v/v乙醇水溶液，3g/L酒石酸，pH 3.5；

 

2.3.芳香化合物

4种目标香气，属于不同的化学类别，具有不同的物理化学特性。

愈创木酚：极性，丁香辛香；

β-苯乙醇：弱极性，玫瑰蜂蜜香气；

己酸乙酯：中等疏水，苹果果香；

β-紫罗兰酮：高疏水，紫罗兰覆盆子香；

 

 

2.4.口腔成分

HS人体唾液：离心去除大分子黏蛋白，富含富脯氨酸蛋白、羧酸酯酶等代谢酶；

AS人工唾液：仅添加猪黏蛋白，无任何代谢酶；

BC颊上皮细胞：细胞膜同时分布亲水、疏水结构域；

 

2.5.酚类化合物

非类黄酮单体（没食子酸）、类黄酮单体（儿茶素）、葡萄籽提取物（原花青素为主）、红酒提取物（花青素为主）。

 

2.5.HS-SPME-GC/MS

 

研究结果

 

3.1.口腔组分对葡萄酒香气挥发性的影响

本研究向人工葡萄酒体系中分别添加人唾液（HS）、人工唾液（AS）、颊上皮细胞（BC），探究不同口腔组分对四种理化性质各异的葡萄酒特征香气物质挥发性的相对作用。上述葡萄酒-口腔复合体系可更好模拟饮酒过程中的口腔生理环境，香气物质在此环境中与各类口腔组分产生不同相互作用。静态顶空分析是解析该类相互作用的最优手段，因此本研究采用该检测方法，同时结合短时间固相微萃取（SPME）进样。

采用单因素方差分析，探究不同口腔组分对愈创木酚、β-苯乙醇、己酸乙酯、β-紫罗兰酮四种香气物质顶空浓度的影响。结果显示，所有待测香气物质的挥发性均会受口腔组分显著调控。根据F值与显著性p值排序，口腔组分对愈创木酚的调控作用最强（F=19.362，p=0.004），其次为β-紫罗兰酮（F=16.637，p=0.012）、己酸乙酯（F=16.282，p=0.012），β-苯乙醇受影响程度最低（F=14.675，p=0.008）。

为明确每种口腔组分对香气挥发性的影响程度，进一步开展图基（Tukey）均值多重比较检验，结果见图1。由图可见，葡萄酒中添加的口腔组分种类不同，对各香气物质挥发性的调控规律存在明显差异。整体来看，添加颊上皮细胞（BC）的葡萄酒体系顶空香气浓度均高于另外两组体系，其中β-苯乙醇受颊上皮细胞的提升效果最为显著。β-苯乙醇属于极性物质，颊上皮细胞的加入会产生盐析效应，降低其在酒液中的溶解度。添加颊上皮细胞与人唾液的体系中，β-紫罗兰酮顶空浓度相近，而仅含黏蛋白的人工唾液体系中该物质挥发性显著更低，这与黏蛋白可吸附滞留疏水性香气物质有关。

颊上皮细胞可代谢多类不同化学结构的挥发性有机物，但本实验条件下未观测到该代谢作用相关证据。对比三类酒液体系可发现，除β-苯乙醇外，其余多数香气物质在人唾液、人工唾液体系中的挥发性差异极大。愈创木酚与己酸乙酯在添加人唾液的体系中挥发性最低（图1a、c）。与之相反，β-紫罗兰酮在人工唾液体系中挥发量最低（图1d），该差异来源于两种唾液的蛋白组成不同。人工唾液仅含黏蛋白，而本实验所用的人唾液经过离心处理，不含这类大分子糖蛋白，主要由低分子量蛋白构成，包括富脯氨酸蛋白、α-淀粉酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂等。已有研究证实香气物质可与不同唾液蛋白发生相互作用，且这类结合作用与香气分子疏水性无直接关联，这也解释了疏水性差异极大的愈创木酚、己酸乙酯在人唾液体系中均被大量滞留的现象。而对于β-紫罗兰酮，人工唾液中大分子黏蛋白可与之高度亲和，人唾液中无该类蛋白，因此前者体系中该物质顶空含量远低于后者（图1d）。

 

 

3.2.酚类物质对含不同口腔组分葡萄酒香气挥发性的影响

第二组实验以添加各类口腔组分的人工葡萄酒为研究对象，探究酚类物质对香气挥发性的调控作用。酚类是葡萄酒中含量最高的非挥发性基质组分，已有大量研究分析其对香气释放的影响，但缺乏同时引入口腔组分、模拟真实品酒口腔环境的相关研究。本实验分别配制添加人唾液（HS）、人工唾液（AS）、颊上皮细胞（BC）三类人工葡萄酒，每类酒液中单独添加了四种酚类物质：没食子酸（GAc）、儿茶素（Cat）、红葡萄酒提取物（RWE）、葡萄籽提取物（GSE）。四种酚类化学结构与理化性质差异明显（图2），推测其与香气物质、口腔组分的相互作用模式各不相同。同时设置未添加任何多酚的HS、AS、BC空白对照酒样。

 

 

首先，为明确不同酚类物质分别在添加人唾液（HS）、人工唾液（AS）、颊上皮细胞（BC）三类人工葡萄酒中对四种香气物质挥发性的影响，本研究对每类酒样的香气顶空峰面积数据分别开展单因素方差分析，并通过图基多重比较检验判定各类酚的单独作用，结果汇总见图3。以愈创木酚为例（图3a），酚类仅在含人工唾液、颊上皮细胞的酒样中产生显著作用，在人唾液体系中无显著影响。人工唾液空白酒与添加没食子酸的酒样顶空愈创木酚含量最高，且二者无显著差异，说明单体酚没食子酸不会改变愈创木酚的挥发性。但图3a同时显示，添加儿茶素、葡萄籽提取物、红酒提取物这类类黄酮多酚的人工唾液体系中，愈创木酚顶空含量降至最低，较空白组下降30%~40%以上。含黏蛋白的人工唾液体系中，类黄酮多酚可通过π-π作用滞留愈创木酚，而人唾液经离心去除了大分子黏蛋白，多酚无法形成稳定结合，因此对愈创木酚无明显抑制效果。

在添加颊上皮细胞（BC）的酒样中，酚类同样显著改变愈创木酚挥发性（图3a）。空白组与添加没食子酸、葡萄籽提取物的样品愈创木挥发水平相近。添加儿茶素后，其挥发性大幅下降，较空白降低50%以上，而添加红酒提取物会产生盐析效应，愈创木酚挥发量较空白提升20%。酚类在BC、AS体系中作用差异，源于颊上皮细胞独特的疏水特性，细胞表面差异化表达多种黏蛋白，同时存在高疏水、高亲水区域，会改变不同多酚与上皮细胞的结合能力，进而间接调控多酚与愈创木酚的相互作用。

对于β-苯乙醇，酚类在HS、AS、BC三类酒样中均会产生显著影响（图3b）。整体上，所有酚类均会降低该物质的挥发量，仅人唾液体系中添加没食子酸出现盐析、挥发上升现象。所有酚类里，类黄酮对β-苯乙醇的抑制效果最强，其中葡萄籽提取物组顶空浓度最低，在BC体系中较空白下降约50%。β-苯乙醇疏水性偏弱且带有芳环，可与类黄酮形成π-π堆叠复合物，这是其挥发性被抑制的合理解释。

多酚对己酸乙酯的挥发性同样存在显著调控作用（图3c）。由辛醇分配系数logP（表1）可知，己酸乙酯属于疏水性香气。有趣的是，多酚在人唾液（HS）与人工唾液（AS）体系中的作用完全不同。人唾液空白组的己酸乙酯顶空释放量最低，添加多酚后，挥发量较空白提升60%以上。尤其是红酒提取物、葡萄籽两种多酚提取物，这两种提取物对己酸乙酯的提升效果相近。已有研究证明香气与多酚可形成弱疏水相互作用，理论上会降低疏水性己酸乙酯的挥发量，但实验结果与之相反。推测原因是多酚可抑制唾液α-淀粉酶、羧酸酯酶等酶活。已有实验证实人唾液酯酶可水解羧酸酯生成羧酸，前文也提到AS无代谢酶、HS含酯酶，是两类酒中己酸乙酯挥发差异的核心原因（图1c）。

人工唾液体系中，空白组与添加多酚组的己酸乙酯整体挥发水平接近，但没食子酸会显著提升其挥发，红酒提取物则显著降低。极性没食子酸改变酒体极性，降低己酸乙酯溶解度、促进释放，而花青素类多酚可与疏水性己酸乙酯形成弱疏水复合物，产生滞留效果。颊上皮（BC）体系规律与人工唾液类似。没食子酸提升己酸乙酯挥发，两种多酚提取物（葡萄籽提取物效果最明显）抑制挥发，符合疏水结合机理。唯独添加儿茶素时，己酸乙酯挥发未下降，反而小幅上升。

最后，酚类仅在HS、BC体系中显著改变β-紫罗兰酮挥发，人工唾液体系无显著作用，且AS组β-紫罗兰酮顶空含量整体最高（图3d），说明该疏水香气与多酚的结合作用在人唾液、颊上皮环境中更强。两类体系中酚的调控规律高度一致，添加没食子酸产生盐析效应，挥发量较空白提升40%以上，高极性酚酸改变酒体溶解度，对疏水性更强的β-紫罗兰酮提升效果比己酸乙酯更突出。添加各类类黄酮后，β-紫罗兰酮顶空含量较空白下降20%以上。人唾液中多酚可与唾液蛋白形成复合物，包裹疏水性香气分子，而人工唾液仅含单一黏蛋白，难以形成该类复合物。此外多酚可直接吸附在颊上皮细胞表面，进而结合β-紫罗兰酮这类疏水香气，降低其挥发量。

 

 

结论

 

本研究采用平衡态静态顶空技术，探究葡萄酒中四种理化性质各异的典型香气（愈创木酚、β-苯乙醇、己酸乙酯）与三类口腔组分（离心人唾液、含黏蛋白人工唾液、颊上皮细胞）的相互作用，证实口腔组分会显著改变香气挥发性，作用强弱随香气种类、口腔组分类型变化。所有待测香气在添加颊上皮细胞的体系中挥发量均更高，人唾液、人工唾液体系间香气释放差异巨大，人唾液中的酯酶可分解愈创木酚、己酸乙酯，降低二者挥发，人工唾液内的黏蛋白则会吸附滞留高疏水的β-紫罗兰酮。

酚类对香气挥发的调控具有双重性，作用取决于香气种类与口腔环境。整体上，没食子酸对极性香气几乎无影响，但会提升高疏水香气（己酸乙酯、β-紫罗兰酮）的释放。类黄酮多酚可显著抑制极性香气（愈创木酚、β-苯乙醇）与人唾液、颊上皮体系中β-紫罗兰酮的挥发，但其作用机理不同，极性香气依靠π-π堆叠结合，β-紫罗兰酮依靠疏水相互作用。类黄酮（葡萄籽、红酒提取物尤为明显）会提升己酸乙酯挥发，原因是多酚可抑制唾液羧酸酯酶，减少己酸乙酯的酶解损耗。

本研究首次系统对比不同口腔生理组分对葡萄酒香气挥发性的影响，证实口腔环境是决定香气-多酚相互作用的关键因素。尽管本实验体系无法完全模拟真实动态饮酒过程，但研究结果可为解析品酒时鼻后香气释放规律提供重要理论依据。