葡萄成熟时，糖分如何快速积累 | The Plant Cell 报道 VvSWEET15 介导葡萄糖和果糖运输的转录调控机制

 

The Plant Cell 报道 VvSWEET15 介导葡萄糖和果糖运输的转录调控机制

 

 

 

导语

 

 

葡萄成熟过程中，糖分积累直接决定果实甜度，也影响酿酒发酵基础和风味形成。叶片合成的蔗糖经韧皮部运输到浆果后，还需要经过卸载、裂解、跨膜转运和液泡储存，最终以葡萄糖和果糖的形式大量积累。

 

中国科学院植物研究所葡萄与葡萄酒科学研发团队在 The Plant Cell 发表题为 The transcription factors ERF105 and NAC72 regulate expression of a sugar transporter gene and hexose accumulation in grape 的研究论文。

 

文章围绕糖转运蛋白 VvSWEET15 展开，发现其在葡萄浆果转色和成熟阶段高度表达，并促进己糖积累；转录因子 VvERF105 和 VvNAC72 分别对 VvSWEET15 产生负向和正向调控，共同影响其时空表达，从而调节葡萄成熟过程中的葡萄糖和果糖积累。

 

 

研究背景

 

葡萄成熟最直观的变化，是果实逐渐变软、上色、变甜。对鲜食葡萄来说，甜度直接影响口感和商品性；对酿酒葡萄来说，糖分决定发酵基础，也会影响酒体、香气和风味。成熟浆果中大量积累的糖，主要是葡萄糖和果糖。它们来自叶片光合作用形成的蔗糖。

 

蔗糖从叶片出发，经韧皮部长距离运输到果实。进入浆果后，蔗糖需要被卸载、裂解，再转运到果肉细胞中，最终大量储存在液泡里。这个过程包括源叶供应、韧皮部运输、果实卸载、己糖转运和液泡积累。任何一个环节发生变化，都可能影响成熟果实的糖含量。

 

糖分积累离不开糖转运蛋白。SUT/SUC、MST、HT、TMT、TST 和 SWEET 等家族成员，分别参与蔗糖和己糖在细胞膜、液泡膜等不同膜系统之间的转运。番茄、甜瓜、西瓜、苹果、梨等果实中，已有多种糖转运蛋白被证明参与糖积累。葡萄中也鉴定到多个 VvHT、VvTMT 和 VvSWEET 成员，但果实成熟阶段哪些转运蛋白承担主要己糖积累功能，还需要进一步解析。

 

SWEET 家族近年来受到关注，因为它们能够介导糖在细胞间或细胞器之间转运。在葡萄中，VvSWEET15 的表达与浆果成熟和己糖含量变化密切相关，尤其在转色启动阶段表现突出。转色期是葡萄品质形成的关键阶段，糖分快速积累，酸度下降，色素和风味代谢逐步启动。因此，VvSWEET15 是否参与这一阶段的己糖积累，以及它受哪些转录因子控制，是理解葡萄高糖形成的重要问题。

 

糖转运蛋白负责糖的跨膜运输，转录因子决定相关基因在什么时间、什么组织、什么强度下表达。围绕 VvSWEET15 的上游调控，该研究进一步鉴定了 VvERF105 和 VvNAC72 两个转录因子。二者对 VvSWEET15 产生相反方向的调控，共同影响葡萄浆果成熟过程中的葡萄糖和果糖积累。

 

 

VvSWEET15

在葡萄转色和成熟阶段显著上调

 

作者首先从 20 份葡萄材料的浆果转录组数据中筛选糖转运蛋白。结果显示，多个糖转运基因在果实发育过程中表达变化明显，其中 VvSWEET15 最突出。与坐果期相比，VvSWEET15 在转色期和成熟期平均上调超过 76 倍，明显高于同家族中常被关注的 VvSWEET10。后者在坐果后平均上调约 16 倍。

 

一些糖转运相关基因则表现出不同趋势。VvHT3/VvHT7、VvSUT12、VvERD6.2 和 VvVGT1 主要在坐果期表达较高，进入转色和成熟阶段后表达下降。VvTMT1/VvHT6 在坐果、转色和成熟阶段都保持较高表达，但到成熟期，VvSWEET15 的表达量已经达到 VvTMT1/VvHT6 的 1.6 倍。这说明 VvSWEET15 很可能在葡萄成熟阶段的糖积累中承担重要作用。

 

随后，作者在酿酒葡萄品种 Chardonnay 中检测 17 个 VvSWEET 家族成员的表达。VvSWEET15 在成熟浆果中高表达；VvSWEET1 和 VvSWEET5a 更多在花中表达；VvSWEET10 则主要在转色期短暂升高。进一步结合糖含量变化可以看到，葡萄糖和果糖在 62–106 DAFB 之间快速积累，并在 134 DAFB 左右趋于稳定。VvSWEET15 转录水平也在 62–106 DAFB 之间迅速升高，106 DAFB 达到峰值，并在成熟后期维持较高水平。蛋白检测结果与转录水平基本一致，说明 VvSWEET15 的积累与葡萄成熟期己糖快速增加高度同步。

 

作者还比较了不同植物中的 SWEET15 同源蛋白。结果显示，SWEET15 在单子叶和双子叶植物中普遍存在，其中甜橙 CsSWEET15 与葡萄 VvSWEET15 亲缘关系最近，氨基酸序列一致性最高。进一步序列比对显示，SWEET15 蛋白中的跨膜结构域和 MtN3 结构域较为保守，这些区域与糖跨膜运输功能密切相关；而非保守区域差异更大，可能与不同物种中的功能分化有关。

 

这一部分结果把 VvSWEET15 从众多糖转运蛋白中筛选出来。它在葡萄转色和成熟阶段强烈上调，表达变化与己糖积累同步，蛋白水平也有对应增加。后续功能验证因此集中在 VvSWEET15 是否直接参与葡萄浆果中葡萄糖和果糖的积累。

 

 

VvSWEET15

定位于浆果维管束韧皮部

 

葡萄浆果中的糖输入依赖发达的维管束网络。作者首先观察了果肉中的网状维管束，以及外周心皮维管束 PCB 和中央心皮维管束 CCB 的基本结构。横切面显示，维管束中包含木质部薄壁细胞、韧皮部细胞，以及周围较大的果肉细胞。糖从韧皮部进入浆果后，还需要经过这些细胞之间的运输，才能进一步积累到果肉细胞中。

 

随后，作者利用原位杂交检测 VvSWEET15 mRNA 的组织定位。结果显示，VvSWEET15 转录本主要出现在 PCB 和 CCB 的韧皮部区域，在木质部和果肉细胞中没有明显信号。转色后期 92 DAFB 的信号强于转色前 62 DAFB，与前面检测到的 VvSWEET15 表达升高趋势一致。

 

为进一步观察蛋白定位，作者制备了 VvSWEET15 特异性抗体，并通过 Western blot 验证其特异性。随后进行免疫荧光定位，发现 VvSWEET15 蛋白主要积累在 PCB 和 CCB 的韧皮部细胞中。绿色荧光信号分布在伴胞或韧皮部薄壁细胞的细胞膜周围，符合 SWEET 蛋白参与跨膜糖转运的功能特征。

 

这组结果表面VvSWEET15 集中在浆果维管束韧皮部相关细胞。它的位置接近糖卸载和再分配的关键区域，提示 VvSWEET15 可能参与蔗糖卸载后己糖向果肉细胞积累的早期运输过程。

 

为了进一步明确 VvSWEET15 在细胞内的位置，作者分别在本氏烟草叶表皮细胞和拟南芥原生质体中表达 VvSWEET15-eGFP 融合蛋白，并用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。结果显示，VvSWEET15-eGFP 的绿色荧光主要分布在细胞外围。与质膜标记蛋白 AtPIP2A-mCherry 共表达后，二者信号高度重叠；用膜染料 FM4-64 标记后，也能看到 VvSWEET15-eGFP 与膜信号一致。由此可以判断，VvSWEET15 主要定位于质膜。

 

结合前面的组织定位结果，VvSWEET15 在葡萄浆果中主要出现在维管束韧皮部相关细胞，并定位于这些细胞的质膜上。这个位置适合参与糖从韧皮部区域向周围细胞转运，与其作为 SWEET 家族糖转运蛋白的功能相符。

 

 

外源葡萄糖和果糖可诱导 VvSWEET15 表达并促进己糖积累

 

为了判断 VvSWEET15 是否参与己糖运输，作者先在本氏烟草中瞬时过表达 VvSWEET15，并连续 6 天浇灌不同糖溶液。结果显示，浇灌 1% 葡萄糖后，VvSWEET15 过表达叶片中葡萄糖和果糖含量分别升高 22.6% 和 12.1%，蔗糖含量没有明显变化。浇灌 1% 果糖后，葡萄糖和果糖也分别升高 17.6% 和 17.9%。相比之下，浇灌 1% 蔗糖并没有显著改变葡萄糖、果糖和蔗糖含量。

 

随后，作者在田间 Chardonnay 葡萄果穗上进行糖灌注实验。转色前 2 周，通过果梗连续灌注 2% 葡萄糖、果糖或蔗糖 48 h，并每 12 h 取样检测。结果显示，葡萄糖处理在 48 h 时使 VvSWEET15 表达升高约 4 倍；果糖处理在 24 h 和 36 h 时使 VvSWEET15 表达分别升高约 7 倍和 9 倍。蔗糖处理对 VvSWEET15 表达没有显著影响。

 

糖含量变化也表现出类似趋势。葡萄糖处理后，浆果中的葡萄糖从 12 h 开始显著升高，果糖从 24 h 开始升高，48 h 时果糖增加 14.9%，蔗糖也增加 18.5%。果糖处理后，葡萄糖和果糖均从 12 h 开始明显升高，但蔗糖含量没有显著变化。蔗糖处理则没有显著促进己糖或蔗糖积累。

 

作者进一步分析 VvSWEET15 启动子，发现其中含有多个糖响应相关元件，包括 SURE1STPAT21、SUCROSE BOX 3、SBOXATRBCS、MYBGAHV 和 PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A。虽然启动子中存在蔗糖响应元件，但实验中蔗糖处理没有明显诱导 VvSWEET15，也没有促进浆果糖积累。整体来看，VvSWEET15 对葡萄糖和果糖信号更敏感，外源己糖可以诱导其表达，并与浆果中己糖快速积累相对应。

 

 

VvSWEET15促进葡萄糖和果糖运输

 

为判断 VvSWEET15 的底物类型，作者使用己糖转运缺陷酵母 EBY4000 进行功能验证。该突变体缺失多个己糖转运蛋白，不能有效利用葡萄糖和果糖。表达 VvSWEET15 后，酵母恢复了葡萄糖和果糖运输能力；而对棉子糖、半乳糖、木糖没有明显改善。进一步使用蔗糖运输相关缺陷酵母 SuSy/ura3 检测后发现，VvSWEET15 不能促进蔗糖运输。由此可以判断，VvSWEET15 主要运输葡萄糖和果糖，不是蔗糖转运蛋白。

 

随后，作者直接在葡萄浆果中进行瞬时遗传转化。由于葡萄稳定转基因结果周期很长，研究选择在巨峰浆果上进行瞬时过表达、RNAi 和 VIGS 实验。转色前 VvSWEET15 本身表达较低，适合做过表达；转色附近 VvSWEET15 表达较高，适合做沉默。

 

过表达 VvSWEET15 后，阳性浆果中 VvSWEET15 转录水平提高约 6.9 倍，蛋白水平同步升高。对应地，葡萄糖和果糖含量分别增加 63.1% 和 67.3%。相反，RNAi 和 VIGS 抑制 VvSWEET15 后，VvSWEET15 转录和蛋白水平均下降，葡萄糖和果糖含量明显降低。RNAi 材料中的葡萄糖和果糖分别降至对照的 28.8% 和 29.8%；VIGS 材料分别降至 21.1% 和 22.4%。这些处理对蔗糖含量影响较小。

 

作者还在番茄中稳定过表达 VvSWEET15，并获得 3 个 T3 代转基因株系。转基因植株整体生长和果实发育与对照差异不明显，但成熟果实中的葡萄糖和果糖含量升高。不同株系中，葡萄糖增加 30.0%–80.2%，果糖增加 16.2%–42.0%。其中葡萄糖提升幅度更高，提示 VvSWEET15 对葡萄糖运输可能更偏好。

 

这部分结果从酵母、葡萄浆果和番茄果实三个层面证明，VvSWEET15 是一个促进己糖积累的糖转运蛋白。它能够运输葡萄糖和果糖，并在葡萄成熟阶段推动浆果中己糖快速积累。

 

 

筛选VvSWEET15的上游调控因子

 

为寻找调控 VvSWEET15 时空表达的转录因子，作者先从 VvSWEET15 启动子中选取主要调控元件，构建串联元件诱饵，用于酵母单杂交筛选。筛选材料来自 Chardonnay、Kyoho 和 Jingxiangyu 不同发育阶段浆果的 cDNA 文库。大规模 Y1H 实验共获得 17 个候选调控因子。

 

进一步验证后，有 7 个候选因子可信度较高，包括 VvPR、VvSELT、VvNAC72、VvUN1、VvUN4、VvCHL 和 VvERF105。随后，作者将这些候选蛋白与 eGFP 融合表达，在拟南芥原生质体和本氏烟草叶表皮细胞中观察亚细胞定位。结果显示，只有 VvERF105 和 VvNAC72 明确定位于细胞核，符合转录因子参与基因表达调控的基本特征。

 

接着，作者比较了 VvERF105、VvNAC72 和 VvSWEET15 在葡萄浆果发育过程中的表达模式。VvERF105 在 72 DAFB 之前表达较高，此时 VvSWEET15 表达较低；进入转色和成熟阶段后，VvERF105 下降。VvNAC72 则在转色期达到高水平，并在成熟过程中保持较高表达，与 VvSWEET15 的表达趋势更接近。这个模式在另外 20 份葡萄材料中也基本一致。

 

蛋白水平检测得到相同趋势。作者制备了 VvERF105 和 VvNAC72 的特异性抗体，并通过 Western blot 验证。结果显示，VvERF105 和 VvNAC72 蛋白积累变化与各自 mRNA 表达相符。

 

这一部分结果把候选调控因子缩小到 VvERF105 和 VvNAC72。从表达时间看，VvERF105 更可能与 VvSWEET15 的低表达阶段相关，VvNAC72 则与 VvSWEET15 在转色和成熟期的高表达同步，为后续分析二者对 VvSWEET15 的相反调控作用提供了依据。

 

 

VvERF105抑制葡萄浆果己糖积累

 

前面的表达分析显示，VvERF105 与 VvSWEET15 呈相反变化。VvERF105 在转色前表达较高，此时 VvSWEET15 水平较低；进入转色和成熟阶段后，VvERF105 下降，VvSWEET15 升高。这个表达关系提示，VvERF105 可能参与抑制 VvSWEET15。

 

作者随后在“巨峰”葡萄浆果中进行瞬时转化。转色前两周过表达 VvERF105，转色附近通过 RNAi 降低其表达。虽然葡萄浆果瞬时转化效率较低，但多次实验后获得了有效阳性材料。与空载对照相比，VvERF105 过表达浆果中，VvSWEET15 转录水平降至 0.36 倍；对应地，葡萄糖和果糖含量分别下降 33.0% 和 28.7%。

 

相反，VvERF105-RNAi 材料中，VvSWEET15 表达升高至 1.65 倍，葡萄糖和果糖含量分别增加 19.1% 和 18.8%。这些处理下，浆果外观差异不明显，说明 VvERF105 对糖积累的影响主要体现在分子和代谢水平。

 

这部分结果表明，VvERF105 是 VvSWEET15 的负向调控因子。在转色前，较高水平的 VvERF105 可能限制 VvSWEET15 表达，使己糖积累维持在较低水平；进入成熟阶段后，VvERF105 下降，有利于 VvSWEET15 上调和葡萄糖、果糖积累。

 

 

VvNAC72促进葡萄浆果己糖积累

 

前面的表达分析显示，VvNAC72 与 VvSWEET15 变化趋势高度一致。进入转色和成熟阶段后，二者表达同步升高，提示 VvNAC72 可能是 VvSWEET15 的正调控因子。

 

作者在“巨峰”葡萄浆果中进行瞬时转化实验。转色前两周过表达 VvNAC72，转色附近通过 RNAi 和 VIGS 降低其表达。过表达 VvNAC72 后，阳性浆果出现轻微着色，说明成熟启动可能提前。分子检测显示，VvNAC72-OE 材料中 VvSWEET15 转录水平升高至 2.6 倍，葡萄糖和果糖含量分别增加 20.5% 和 21.6%。

 

相反，抑制 VvNAC72 后，VvSWEET15 表达下降。VvNAC72-RNAi 材料中，VvSWEET15 降至 0.56 倍，葡萄糖和果糖分别下降 18.2% 和 14.0%；VvNAC72-VIGS 材料中，VvSWEET15 降至 0.75 倍，葡萄糖和果糖分别下降 7.3% 和 9.2%。Western blot 结果也显示，VvNAC72 蛋白水平与转录水平变化一致。

 

组织定位进一步支持这一关系。原位杂交显示，VvNAC72 在转色前和转色后都主要出现在浆果维管束韧皮部区域；免疫定位也显示 VvNAC72 蛋白主要积累于韧皮部细胞。这个空间分布与 VvSWEET15 高度重合。

 

这些结果说明，VvNAC72 是 VvSWEET15 的正调控因子。在葡萄转色和成熟过程中，VvNAC72 在韧皮部相关细胞中积累，促进 VvSWEET15 表达，进而推动葡萄糖和果糖积累。

 

 

VvERF105和VvNAC72

直接结合VvSWEET15启动子

 

为确认 VvERF105 和 VvNAC72 是否直接调控 VvSWEET15，作者进一步开展了 Y1H、Dual-LUC、EMSA 和 ChIP-qPCR 实验。

 

酵母单杂交结果显示，VvERF105 和 VvNAC72 都可以与 VvSWEET15 启动子互作。双荧光素酶实验进一步表明，二者对 VvSWEET15 的调控方向相反：VvERF105 降低 VvSWEET15 启动子活性，VvNAC72 提高 VvSWEET15 启动子活性。这与前面葡萄浆果瞬时转化实验中的结果一致。

 

随后，作者用 EMSA 分析二者的具体结合位点。结果显示，VvNAC72 可以结合 VvSWEET15 启动子中的 CACATG 元件，这是典型 NAC 结合序列。VvERF105 没有结合 DRE 核心元件 CCGAC，也没有结合 MYB 相关元件 CCGTTG，而是与 LTR 元件 CCGAAA 发生结合。

 

ChIP-qPCR 在葡萄浆果中进一步验证了这一结果。VvERF105-HA 富集在含有 CCGAAA 元件的启动子片段上，VvNAC72-HA 富集在含有 CACATG 元件的片段上。体外 EMSA 和体内 ChIP-qPCR 结果相互支持，说明二者确实可以直接结合 VvSWEET15 启动子。

 

综合来看，葡萄转色前 VvERF105 表达较高，它结合 VvSWEET15 启动子中的 CCGAAA 元件，限制 VvSWEET15 表达，使己糖积累维持在较低水平。转色后，VvNAC72 表达升高，结合 CACATG 元件并激活 VvSWEET15，促进葡萄糖和果糖积累。这解释了 VvSWEET15 为什么会在葡萄转色和成熟阶段大量表达。

 

 

AgriPulse 评论

 

文章从 VvSWEET15 的表达特征切入，逐步连接到糖运输功能和上游转录调控：先通过转录组筛出其在转色期和成熟期高表达，再用定位、酵母运输和果实转化证明它参与葡萄糖、果糖积累，最后追到 VvERF105 和 VvNAC72 对 VvSWEET15 的相反调控。最需要注意的是葡萄本体验证仍偏弱，主要依赖浆果瞬时过表达、RNAi 和 VIGS，阳性率低，有效果粒数量有限；同时，VvSWEET15 定位在韧皮部相关细胞质膜上，而糖最终大量储存在果肉细胞液泡中。文章证明了 VvSWEET15 是葡萄己糖积累中的重要运输节点，但从韧皮部卸载到果肉液泡积累的完整路径，还需要更多证据补足。

 

Lizhen Lu, Serge Delrot, Peige Fan, Zhan Zhang, Die Wu, Fengqin Dong, Pedro García-Caparros, Shaohua Li, Zhanwu Dai, Zhenchang Liang, The transcription factors ERF105 and NAC72 regulate expression of a sugar transporter gene and hexose accumulation in grape, The Plant Cell, Volume 37, Issue 1, January 2025, koae326, doi.org/10.1093/plcell/koae326