J INTEGR AGR：VqMAPK3‑VqERF1B‑VqPRs分子模块调控葡萄对白粉菌的抗性

VqMAPK3‑VqERF1B‑VqPRs分子模块调控葡萄对白粉菌的抗性

期刊：Journal of Integrative Agriculture（5.4）

发表日期：2026年

 

 

引言

 

葡萄是栽培历史悠久、经济与营养价值突出的重要果树作物。欧洲葡萄（V. vinifera）风味香气优良，是商业化生产的主栽品种。但绝大多数欧洲葡萄栽培品种对白粉菌高度敏感；白粉菌能够侵染葡萄所有绿色组织，造成严重的产量与品质损失。依赖杀菌剂的传统病害防控模式不仅破坏生态环境，还会威胁人类健康。因此，提高葡萄自身对白粉病的抗性，是抗病育种亟待攻克的难题。随着葡萄遗传转化与基因编辑技术取得突破，通过分子育种改良欧洲葡萄的感病特性成为可行路径。利用分子手段挖掘抗病基因，能够为葡萄抗病育种提供宝贵基因资源，助力环境友好型葡萄产业发展。遭遇病原物侵染时，植物会启动复杂的防御系统：合成植物激素、活性氧，发生超敏反应，同时大规模重编程病程相关（PR）基因的转录。PR蛋白是系统获得抗性（SAR）的核心组分，可保护未被侵染的植物组织免受二次侵染。已有大量研究表明，真菌侵染后，植株侵染位点以及远端未侵染组织的PR基因表达水平显著上调，充分证明PR基因在抗病中的功能，因此PR基因常被用于转基因改良，以提升植物广谱抗病能力。例如，在欧洲葡萄中过表达PR4可以增强对白粉菌抗性；PR5蛋白具备较强的抗菌活性，在多种植物中过表达均可提升对多种病原物的抵抗能力。

AP2/ERF是植物特有的转录因子家族，在调控植物生长发育与防御应答中扮演关键角色。大量ERF家族成员是植物抵御病原入侵的核心调控因子。例如过表达MdERF100、HvERF1V、MiERF4、PbrERF1B2，可通过调控茉莉酸、水杨酸、乙烯多条激素信号通路提升植物抗病性。不少研究证实，ERF转录因子可上调PR基因表达，进而增强植物对真菌病害抗性。葡萄基因组共鉴定出113个ERF转录因子，其中35个受灰霉菌侵染诱导。已有研究显示，葡萄VaERF16、VaERF20、VqERF072、VqERF112、VqERF114过表达，能够诱导防御基因表达，提升植株对灰霉菌、番茄丁香假单胞菌的抗性。近期研究发现VqERF062直接结合VqNSTS2启动子，促进白藜芦醇类物质合成，增强葡萄白粉病抗性。尽管ERF转录因子在植物抗病中的作用已有报道，但ERF调控葡萄抵御白粉病的分子机制尚不清晰。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联通路是介导植物抗病的核心信号通路，能够磷酸化下游包括ERF在内的转录因子。拟南芥MPK3、MPK6可以磷酸化ERF6、ERF72，提升植株对灰霉病抗性；小麦TaMKK5TaMPK3模块通过正向调控TaERF3活性，增强植株对小麦纹枯病抗性；番茄SlMAPK8磷酸化SlERF.C1后，后者转录活性提高，激活PR基因表达，增强对灰霉病抗性。葡萄共鉴定出14个MAPK基因，VvMPK1、VvMPK9、VvMPK10、VqMPK3、VqMPK4、VqMPK6均可被白粉菌侵染诱导。目前仅发现VqMAPK3/6能够磷酸化VqWRKY33，促进白藜芦醇合成，提升葡萄白粉病抗性；MAPKERF调控模块参与葡萄抗白粉病的功能尚未被揭示。

我国是葡萄的起源中心之一，拥有极为丰富的野生葡萄种质资源。科研人员对近百份野生葡萄资源开展抗病评价，发现中国野生毛葡萄‘丹凤2’对白粉病具有高抗性，受到学界广泛关注。本研究从‘丹凤2’中克隆得到受白粉菌诱导表达的ERF转录因子VqERF1B。表型实验证实，VqERF1B能够降低孢子数量、促进PR蛋白积累、诱发细胞死亡、提升活性氧水平，以此增强葡萄对白粉病抗性。VqERF1B与VqMAPK3互作，共同激活VqPR1、VqPR5、VqPR10等病程相关基因。本研究明确VqERF1B在葡萄抗白粉病通路中的重要功能，为利用分子育种创制抗白粉病葡萄新种质提供理论依据。

 

结果

 

2.1白粉菌接种后VqERF1B显著高表达

为筛选白粉病抗病候选基因，课题组对抗病材料毛葡萄‘丹凤2’（D2）与感病材料欧洲葡萄‘无核白’（TS）进行白粉菌接种后的转录组测序（图1A）。转录组结果筛选出10个表达量显著上调的ERF转录因子，并绘制热图（图1B）。其中VqERF1B仅在抗病材料‘丹凤2’中特异性高水平表达。qRTPCR进一步检测该基因响应白粉菌侵染的表达模式：白粉菌侵染后，‘丹凤2’中VqERF1B表达被强烈诱导；但在感病品种‘无核白’中，该基因表达无明显变化（图1C、D）。以上结果提示，VqERF1B很可能在葡萄抵御白粉菌的防御应答中发挥关键作用。

 

 

2.2VqERF1B的分离与蛋白特征分析

为解析VqERF1B的生物学功能，本研究分析其基因结构、转录激活活性以及亚细胞定位。VqERF1B定位于5号染色体，编码蛋白含有典型AP2保守结构域（图2A、B）。系统进化树分析显示，VqERF1B与葡萄VvERF1B、牵牛花InERF1B亲缘关系最近（图2C）。蛋白二级结构预测表明，该蛋白由51.92%α螺旋、10.10%延伸链、4.33%β转角、33.65%无规则卷曲构成（图2D）。将35SVqERF1BGFP融合载体与拟南芥细胞核标记基因AtHY5mCherry共同转化拟南芥原生质体，荧光共聚焦观察发现VqERF1BGFP荧光信号与细胞核标记信号完全重合，证明VqERF1B定位于细胞核（图2E）。构建VqERF1B全长以及不同截短片段与DNA结合域BD的融合载体，酵母转化实验表明完整VqERF1B可以激活报告基因表达，对照组无激活活性，证明VqERF1B是转录激活子（图2F）。

 

 

2.3VqERF1B增强葡萄对白粉菌的抗性

为确认VqERF1B参与葡萄白粉病防御应答，在‘丹凤2’叶片开展瞬时过表达实验（图3A）。qPCR检测显示，过表达株叶片中VqERF1B转录水平是空载体对照的8.1倍，证明瞬时过表达成功（图3B）。接种白粉菌7天后，空载体对照组叶片布满白色菌丝；而过表达VqERF1B叶片菌丝稀疏（图3C）。显微观察结果显示，7dpi时，对照组叶片的真菌菌丝、分生孢子发育远多于VqERF1B过表达叶片（图3D）。孢子计数、过氧化氢含量测定结果显示，过表达植株叶片每克组织孢子数量显著更少，H₂O₂积累量显著高于对照（图3E、F），与表型结果保持一致。说明过表达VqERF1B能够增强葡萄对白粉菌的抗性。为解析背后机制，检测病程相关基因表达：白粉菌侵染后，VqERF1B瞬时过表达叶片中VqPR1、VqPR3、VqPR4、VqPR5表达显著上调（图3G），提示PR基因的高表达促成植株抗病表型。利用RNA干扰技术沉默‘丹凤2’叶片内源VqERF1B，沉默材料基因表达量仅为空载体干扰对照的20%，沉默效果良好（图3B）。7dpi表型观察发现，沉默VqERF1B叶片菌丝与分生孢子生长显著多于干扰对照组；台盼蓝染色、孢子计数同样证实，沉默植株孢子产生、初级附着胞、次生孢子发育均显著增强（图3D、E）。综合以上结果，抑制VqERF1B表达会削弱葡萄对白粉菌的抵抗能力。

 

 

2.4VqERF1B提升拟南芥对白粉病的抗性

构建VqERF1B过表达拟南芥株系，进一步验证该基因抗病功能。对野生型Col0与3个T₃代纯合转基因株系OE#4、OE#9、OE#12接种拟南芥白粉病菌Golovinomycescichoracearum（图4A）。7dpi，野生型叶片黄化，布满白色真菌菌落；而转基因株发病程度明显更轻（图4B）。孢子定量统计证实，转基因植株真菌定殖量显著低于野生型（图4D）。台盼蓝染色、扫描电镜观察细胞死亡与真菌生长：转基因叶片出现大量深蓝色斑点，代表发生超敏细胞死亡；而Col0叶片几乎无染色。扫描电镜可见野生型叶片菌丝、分生孢子大量增殖，转基因株真菌发育受抑（图4C）。DAB染色检测H₂O₂、NBT染色检测超氧阴离子O₂⁻・，接种7dpi后，转基因株叶片染色程度更深；定量测定也表明转基因植株H₂O₂含量显著高于野生型，代表活性氧大量积累（图4C、E）。检测PR基因表达：白粉菌侵染后，转基因拟南芥植株PR基因表达水平大幅上调（图4F）。以上结果说明，VqERF1B在异源系统拟南芥中同样可以通过诱导PR基因表达、促进活性氧积累，提高植株白粉病抗性。

 

 

2.5VqERF1B与VqMAPK3发生蛋白互作

植物MAPK级联通路通过磷酸化下游转录因子传递生物胁迫信号，调控植物对各类刺激的应答。葡萄基因组共14个MAPK基因。为探究VqERF1B介导的抗病是否受到MAPK磷酸化通路调控，将全部14个葡萄MAPK克隆构建AD载体，开展酵母双杂交筛选，筛选得到候选互作蛋白VqMAPK3。

酵母双杂交（Y2H）实验证明VqERF1B和VqMAPK3在酵母细胞内存在互作（图5A）。双分子荧光互补实验（BiFC）：VqERF1B与VqMAPK3共转化拟南芥原生质体后，细胞核观察到YFP荧光信号，空载对照组没有荧光，证明二者在植物细胞核内互作（图5B）。免疫共沉淀CoIP进一步在植物体内验证二者物理相互作用（图5C）。综合体外、体内实验，VqERF1B与VqMAPK3存在真实蛋白互作。

 

 

3.6VqERF1B与VqMAPK3协同激活VqPRs基因表达

前面结果表明，VqERF1B过表达葡萄叶片与转基因拟南芥中PR基因表达量显著升高。为探究VqERF1B是否直接结合VqPRs基因启动子，对启动子顺式作用元件分析，发现多个ERF蛋白识别结合位点，包括GCCbox、RAA基序、ERE、DRE元件。

酵母单杂交Y1H实验显示，VqERF1B能够特异性结合VqPR1、VqPR5、VqPR10的启动子，但不结合VqPR2启动子（图6A）。提示VqERF1B通过直接结合PR基因启动子区域的RAA等顺式元件，激活转录，参与抗病。

双荧光素酶报告实验探究VqMAPK3与VqERF1B互作对PR基因转录的影响（图6B）。结果显示，单独表达VqERF1B效应蛋白即可显著提高ProVqPR1、ProVqPR5、ProVqPR10报告基因活性；而VqERF1B与VqMAPK3共同表达时，报告基因LUC活性比VqERF1B单独作用更高（图6C）。说明VqERF1B和VqMAPK3协同激活VqPR1、VqPR5、VqPR10转录。

 

 

讨论

 

挖掘中国野生葡萄抗病关键调控基因、解析其抗白粉病分子机制，对培育抗病新品种、推动葡萄产业绿色可持续发展至关重要。野生葡萄中ERF、MYB、WRKY、bZIP等多种转录因子参与植物抵御病原侵染。其中ERF转录因子在葡萄抗灰霉病方面已有较多研究，但ERF参与葡萄抗白粉病的报道还相对较少。近期报道VqERF062通过促进白藜芦醇积累提高白粉病抗性。本研究发现，抗病毛葡萄‘丹凤2’中，白粉菌侵染强烈诱导另一个ERF转录因子VqERF1B表达。同源、异源过表达VqERF1B均可提高植株白粉病抗性；瞬时沉默该基因则植株抗病性下降。上述结果和已有研究结论一致，证明ERF转录因子在葡萄抗白粉病防御通路中占据重要地位。

活性氧（ROS）能够糖蛋白交联加固寄主细胞壁，构筑抵御病原入侵的物理屏障，同时诱导程序性细胞死亡，是植物防御反应的重要组分。本研究中，VqERF1B过表达植株孢子发育受抑制、病害症状减轻，同时ROS积累水平上升。这与很多抗病研究结果一致，病原诱导的ROS有助于提升植物免疫。但该结果和VaERF20抵御灰霉病的现象不同：过表达VaERF20拟南芥抗病性提升，ROS水平却降低。这种差异可能来源于不同病原激活的防御通路不一样。

PR蛋白是植物先天免疫系统核心组分，也是防御激活的标志性分子。大量研究证实ERF转录因子直接调控PR基因表达介导抗病。玉米ZmERF105、ZmERF061上调PR基因，提高对大斑病抗性；大豆GmERF113过表达植株中GmPR1、GmPR101升高，抵抗大豆疫霉菌。本研究中，葡萄叶片瞬时过表达VqERF1B、拟南芥异源过表达VqERF1B后，白粉菌处理下多个PR基因转录水平上调。证明VqERF1B至少部分通过调控PR基因转录，介导葡萄对白粉病抗性。

ERF转录因子通常依靠和其他蛋白互作实现生物学功能。MAPK磷酸化转录因子是调控植物抗病的重要机制。拟南芥、小麦、番茄中已经报道多条MAPKERF免疫调控模块；但葡萄抵御白粉菌过程中MAPK通路是否直接调控ERF尚不明确。本研究证实VqERF1BVqMAPK3蛋白复合体正向调控葡萄抗白粉病，和AtMPK3/6ERF6/72、TaMPK3ERF3等模块功能类似。本实验中VqERF1B不与VqMAPK6互作，与前人发现MPK3、MPK6功能不完全冗余的观点相吻合，说明二者在植物胁迫信号中存在非重叠功能。

本研究仍存在一定局限：VqMAPK3对VqERF1B的具体磷酸化位点尚未鉴定。后续将鉴定该磷酸化位点，进一步解析VqERF1B介导的抗病通路，加深对葡萄白粉病抗性机制的理解。

 

结论

 

本研究鉴定得到一个定位于细胞核的ERF转录因子VqERF1B，它是葡萄抗白粉病的关键调控蛋白。提出工作模型：VqERF1B通过调控病程相关PR基因表达，增强葡萄对白粉菌抗性；VqERF1B与VqMAPK3形成转录复合体，结合PR基因特定启动子区域，共同介导抗病反应（图7）。本研究拓展了ERF转录因子在葡萄抗白粉病中的功能与调控机制认知，为分子育种改良葡萄抗病性提供新思路。