J. Anim. Sci：酿酒副产物提取物在瘤胃模拟发酵系统中对瘤胃微生物群落及其发酵活性的影响

酿酒副产物：葡萄渣、葡萄籽粕及葡萄籽提取物在瘤胃模拟发酵系统（RUSITEC）中对瘤胃微生物群落及其发酵活性的影响

期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology（6.5）

发表日期：2023年

 

研究摘要

背景：葡萄及酿酒副产物对牛具有营养价值，且含有酚类等功能性化合物，这些化合物不仅能与蛋白质结合，还能直接影响瘤胃微生物群及其功能。本研究采用瘤胃模拟技术（RUSITEC），分析葡萄籽粕、葡萄渣的营养和功能效应，以及葡萄酚类物质的有效剂量对瘤胃微生物群和发酵特性的影响。

结果：本研究比较了6种饲料（每种饲料n=8），包括对照饲料（CON，不含副产物）、阳性对照饲料（EXT，在CON基础上添加3.7%干物质（DM）基础的葡萄籽提取物）、两种葡萄籽粕饲料（GS-low，5%干物质基础；GS-high，10%干物质基础）以及两种葡萄渣饲料（GP-low，10%干物质基础；GP-high，20%干物质基础）。添加副产物后，EXT、GS-low、GS-high、GP-low和GP-high向饲料干物质中提供的总酚含量分别为3.4%、0.7%、1.4%、1.3%和2.7%。饲料在4个试验周期中进行测试。与CON相比，所有处理组均降低了氨浓度以及干物质（DM）和有机物（OM）的消失率（P<0.05）。与CON相比，EXT和GP-high降低了丁酸以及奇数和支链短链脂肪酸的含量，同时提高了乙酸含量（P<0.05）。各处理组对甲烷生成无影响。EXT降低了多种细菌属的丰度，包括核心微生物群中的细菌属。GP-high和EXT均降低了Olsenella和Anaerotipes的丰度，同时提高了Ruminobacter的丰度。

结论：数据表明，添加酿酒副产物或葡萄籽提取物可作为减少过量氨生成的一种选择。以提取物形式高剂量接触葡萄酚类物质会改变瘤胃微生物群落，但与饲喂高剂量酿酒副产物相比，这并不一定会改变葡萄酚类物质对微生物群落功能的影响。这表明在影响瘤胃微生物活性方面，葡萄酚类物质的剂量比其形式或来源更具主导作用。总之，向饲料干物质中添加约3%的葡萄酚类物质是一种有效的剂量，且瘤胃微生物群可耐受该剂量。

背景

酚类化合物会产生多种效应，如结合蛋白质、改变瘤胃微生物组成以及调节微生物活性，但这些效应的模式和强度会因酚类化合物的剂量和植物来源而异。迄今为止，研究主要集中在植物提取物和生物活性化合物上，其中许多来源于外来且集约管理的资源，如树皮提取物、树叶提取物和纯化的植物生物活性化合物，而来自富含酚类物质植物的农业工业副产物尚未得到充分研究。因此，利用这些更常见的资源（尤其是含量丰富的资源，如葡萄和酿酒副产物）的益处具有合理性。

葡萄（Vitis vinifera L.）在全球范围内广泛种植，是酚类化合物（尤其是类黄酮）的常见食物来源。葡萄酒、葡萄籽提取物等葡萄制品的健康益处已在以往研究中有所描述。葡萄酒、葡萄籽油和葡萄衍生补充剂的生产过程中会产生大量副产物，如葡萄渣和葡萄籽粕。将葡萄和酿酒副产物转化为反刍动物饲料来源，是对这些废弃物进行升级利用的有效方式——若不妥善处理，这些废弃物中的单宁会对土壤质量和生态系统产生不利影响，从而带来环境问题。葡萄和酿酒副产物可能具有双重益处，既可用作潜在的饲料来源，也可作为功能性化合物的来源。尽管这些资源储量丰富，但关于将葡萄和酿酒副产物用于反刍动物饲养的营养学研究仍较少。已有部分针对小型反刍动物的研究数据，但针对牛的研究数据更少，且由于饲养条件和剂量的巨大差异，现有数据结论并不一致。迄今为止的研究表明，葡萄和酿酒副产物对甲烷生成具有缓解作用，同时还能提高牛奶蛋白质产量，这表明葡萄酚类物质可能影响瘤胃氮代谢，从而减少饲料蛋白质因瘤胃降解造成的损失。然而，关于瘤胃微生物群如何响应葡萄酚类物质，目前知之甚少，因此其有效剂量和耐受水平尚不明确。需要注意的是，除补充剂量外，饲料组成也会影响植物成分对瘤胃微生物群和发酵的作用。

本研究采用瘤胃模拟技术（RUSITEC），比较了不同添加水平的葡萄籽粕、葡萄渣与葡萄籽提取物补充剂的效应。连续培养等体外模型是反刍动物营养学和微生物学研究的宝贵工具，有助于减少对实验动物的需求，从而降低相关伦理问题。将葡萄和酿酒副产物添加到高质量干草饲料中，旨在抵消高质量干草此前被证实的过量产氨缺点。高质量干草含有高蛋白和高易消化碳水化合物，而葡萄籽粕和葡萄渣则蛋白质含量低、纤维碳水化合物含量高。因此，除酚类化合物的功能效应外，添加这些副产物引起的营养成分变化对瘤胃发酵和微生物群落的影响也值得关注。本研究的最终目标为：（1）区分葡萄籽粕和葡萄渣的营养效应与功能效应；（2）确定瘤胃微生物可耐受的葡萄酚类物质有效剂量。为实现这些目标，将副产物处理组与阳性对照（添加葡萄籽提取物）和阴性对照（未添加副产物）进行对比。

方法

2.1 饲料处理（Dietary treatments）

 

 

2.2 瘤胃模拟技术（RUSITEC）操作流程（RUSITEC procedure）

 

2.3 采样与化学分析（Sampling and chemical analyses）

 

2.4 DNA提取、扩增与测序（DNA extraction, amplification, and sequencing）

 

2.5 生物信息学与数据分析（Bioinformatics and data analysis）

 

2.6 统计分析（Statistical analysis）

结果

3.1 瘤胃发酵特性（Ruminal fermentation characteristics）

如表2所示，处理组对发酵液pH值有影响（P=0.006），与CON和EXT相比，GP-low和GS-high提高了pH值（P<0.05），而氧化还原电位不受处理组影响。添加葡萄和酿酒副产物降低了氨浓度（P<0.001）。其中，GP-high的抑制作用最强，与CON相比降低了22%；其次是EXT（降低17%）、GS-high和GP-low（降低10%-12%）以及GS-low（降低5.6%）（P<0.05）。对比分析还显示，酿酒副产物类型对氨浓度有影响（GP vs. GS，P<0.001）。在发酵气体体积和气体组成方面，副产物处理组与CON之间无差异，各处理组的发酵气体产量相似。与副产物处理组相比，EXT降低了甲烷百分比（P<0.01）。

与CON相比，GP和GS-high处理组降低了挥发性脂肪酸（VFA）浓度（降低5%-8%）（P<0.05），但仅EXT和GP-high影响了挥发性脂肪酸组成（见表2）。与CON相比，EXT和GP-high提高了乙酸百分比，同时降低了丁酸、异丁酸、戊酸和己酸的百分比（P<0.05）。添加葡萄渣降低了异戊酸百分比，与添加葡萄籽粕相比差异显著（对比分析P=0.002）。发酵液的抗氧化能力不受处理组影响。

除GS-low外，所有处理组均降低了瘤胃干物质（DM）和有机物（OM）的消失率，与CON相比差异显著（P<0.05，见表3）。EXT（降低3.6%，P<0.05）和GP-high（降低3%，P<0.10）的粗蛋白（CP）消失率低于CON。与CON相比，所有处理组的氨浓度（按降解粗蛋白量标准化）均降低了约14%-18%（P<0.05）。与CON和EXT相比，GP和GS处理组降低了灰分消失率。与CON相比，GP-low提高了乙醚提取物（EE）消失率（提高16%，P<0.05），而EXT则有降低乙醚提取物消失率的趋势（降低13%，P<0.10）。与其他组相比，GP处理组降低了中性洗涤纤维（NDF）消失率（P<0.01）。酸性洗涤纤维（ADF）消失率不受处理组影响。

对比分析显示，与添加葡萄籽粕相比，添加葡萄渣降低了干物质（DM）、有机物（OM）、粗蛋白（CP）和中性洗涤纤维（NDF）的降解率，同时提高了乙醚提取物（EE）的降解率（P<0.01）。以单位降解有机物对应的挥发性脂肪酸浓度表示的发酵效率，在所有处理组间相似，但GP-low低于CON（P<0.10）。单位降解有机物对应的甲烷产量不受处理组影响。按降解粗蛋白单位标准化后，所有副产物处理组和EXT处理组在降低氨浓度方面的效果与CON相比均相似（P<0.05）。

表2 饲料处理对发酵液发酵特性的影响

3.2 瘤胃微生物群（Ruminal microbiota）

共导入1,751,485条合并读数用于分析，其中1,749,120条高质量读数用于后续样品分析。最终数据集包含4,322个ASVs，每个样品平均有30,354条读数。如表4所示，处理组对观察到的ASVs数量有影响（P=0.01），尤其是CON与GP-high之间差异显著（P<0.05）。各处理组的α多样性指数（Shannon指数、Simpson指数和Fisher指数）相似。通过非度量多维尺度分析（NMDS）未发现各处理组的β多样性存在差异，但典范对应分析（CCA）显示EXT与其他处理组存在分离（P=0.046，图1）。

 

表3 饲料处理对营养物质降解和发酵效率的影响

 

表4 饲料处理对发酵液中微生物群α多样性的影响

 

图2展示了属水平的核心微生物群。丰度最高的五个已分类属为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、氨基酸球菌属（Acidaminococcus）和理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae RC9 gut group），它们在大多数样品中均具有较高的相对丰度（出现率80%-100%）。部分属存在较高的异质性，例如约一半样品中琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）的相对丰度约为0.3%，而其余样品中该属的丰度更高。并非所有核心属都受处理组影响（图3）：丰度最高的五个核心属未受影响，而其他主要属（在大多数样品中相对丰度约为1%）——包括毛螺菌科NK3A20群（Lachnospiraceae NK3A20 group）、琥珀酸单胞菌属（Succiniclasticum）、瘤胃球菌科UGC-002（Ruminococcaceae UGC-002）、克里斯滕森菌科R-7群（Chistensenellaceae R-7 group）——的丰度被EXT降低，而密螺旋体属2（Treponema 2）的丰度被EXT提高（P<0.05）。EXT对Olsenella属有影响趋势（P<0.075）。

 

EXT通常会降低低丰度属的丰度，但以下属除外：U29 BO3、链球菌属（Streptococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、瘤胃杆菌属（Ruminobacter）、假丁酸弧菌属（Pseudobutyrivibrio）、纤维杆菌属（Fibrobacter）、肠杆菌属ventriosum群（Eubacterium ventriosum group）、内共生菌属（Candidatus Endomicrobium）和厌氧弧菌属（Anaerovibrio）。GP和GS处理组对属的影响较少：GP-low和GP-high降低了厌氧棍状菌属（Anaerostipes）的丰度，但提高了瘤胃杆菌属（Ruminobacter）的丰度（P<0.05）；两种GP处理均降低了氨基酸球菌属（Acidaminococcus）的丰度（P<0.05）；仅GP-high降低了Olsenella属的丰度，提高了普雷沃氏菌科NK3B31群（Prevotellaceae NK3B31 group）的丰度（P<0.05），且有降低13科UGC-001（Family XIII UCG-001）和普雷沃氏菌科UGC-004（Prevotellaceae UGC-004）丰度的趋势（P<0.010）；GS-low降低了甲烷球形菌属（Methanosphaera）的丰度（P=0.05）；GS-high对属水平的相对丰度无影响。甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）是样品中被鉴定为核心微生物群一部分的古菌属（图2）。EXT降低了甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）和甲烷球形菌属（Methanosphaera）的丰度（P≤0.05）（图3）。

在种水平上，与其他处理组相比，EXT的效应最强（图4）。与CON相比，EXT提高了布氏普雷沃氏菌（Prevotella bryantii）、产琥珀酸纤维杆菌琥珀酸亚种（Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes）、普雷沃氏菌属R79（Prevotella sp. R79）和嗜糖密螺旋体DSM 2985（Treponema saccharophilum DSM 2985）的读数丰度，但降低了纤维分解丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）和布氏密螺旋体（Treponema bryantii）的读数丰度（P<0.01）。与CON相比，GP-high有提高布氏普雷沃氏菌（Prevotella bryantii）（P=0.09）和产琥珀酸纤维杆菌琥珀酸亚种（Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes）（P=0.05）丰度的趋势。

图5展示了与瘤胃发酵变量或目标通路具有高正相关或负相关系数（阈值高于0.70，详见补充表2）的微生物属。在发酵变量中，pH值（pH10）与琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）和甲烷微球菌属（Methanimicrococcus）呈正相关，而总挥发性脂肪酸浓度与这两个属呈负相关。按降解粗蛋白校正的氨浓度（即图5中的NH3CP）与琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）呈正相关。异戊酸百分比（isoValerate10_p）与棒状杆菌属（Clavibacter）和FD2005呈正相关，粗蛋白降解率（DCP）与柔膜菌门RF39（Mollicutes RF39）和产糖发酵菌属（Saccharofermentans）呈正相关。产糖发酵菌属（Saccharofermentans）与PWY-5677（琥珀酸发酵生成丁酸）和PWY-5022（4-氨基丁酸降解途径V）呈正相关。许多属与乙酸和丁酸合成相关的通路呈正相关。

Mogibacterium属与P163-PWY（L-赖氨酸发酵生成乙酸和丁酸）、PWY-5022、PWY-5676（琥珀酸发酵生成丁酸）、PWY-5677呈极高正相关（相关系数高于0.90），与CENTFERM-PWY（丙酮酸发酵生成丁酸）和P162-PWY（L-谷氨酸降解途径V）呈较低程度正相关（相关系数0.76-0.82）。被EXT抑制的多个属（包括甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、Olsenella属（也被GP-high降低）、毛螺菌科NK3A20群（Lachnospiraceae NK3A20 group）、琥珀酸单胞菌属（Succiniclasticum）、瘤胃球菌科UGC-010（Ruminococcaceae UGC-010）和内共生菌属（Candidatus Saccharimonas））均与乙酸和丁酸合成相关通路呈相关。仅在GP处理组中丰度提高的氨基酸球菌属（Acidaminococcus）与PWY-190.3（硝酸盐还原途径VI）和P162-PWY呈相关。

讨论

类黄酮（包括三环分子和聚合物结构）是葡萄中可溶性酚类物质的主要类别。葡萄酒生产后，葡萄渣中仍保留大量总酚含量。本研究中，饲料中酿酒副产物添加量的增加提高了饲料酚类物质含量。当饲料干物质中酿酒副产物添加量为20%时，其提供的葡萄总酚含量接近饲料干物质的3%。

添加葡萄和酿酒副产物最显著的效应是降低氨浓度，且在提供更高酚类物质含量的处理组（EXT和GP-high）中，该效应更强，这表明存在酚类物质的剂量效应。EXT和GP-high降低氨浓度的同时，也降低了粗蛋白（CP）的消失率。在瘤胃pH值范围内，酚类化合物可与可溶性蛋白质结合，从而减少瘤胃中蛋白质的过量降解，这一现象在单宁研究中已频繁被描述。与GS和GP处理组不同，EXT的效应排除了添加酿酒副产物相关的物理和营养特性变化对结果的影响。因此，本研究数据为葡萄生物活性化合物在减少饲料蛋白质因瘤胃微生物发酵造成的损失方面的作用提供了证据，这与以往针对奶牛的研究结果一致——该研究指出葡萄渣和葡萄籽提取物可提高进入小肠的蛋白质流量，进而提高产奶量。

本研究进一步表明，按降解粗蛋白单位标准化后，所有处理组的效果相似，均使氨浓度降低约14%-18%。体外条件排除了宿主瘤胃吸收对瘤胃氨池的贡献，因此数据表明，即使是低剂量的葡萄酚类物质，也能改变瘤胃氮代谢的中间步骤（如脱氨作用和氨用于微生物蛋白质合成的过程）。但需注意的是，当前体外研究未测定微生物蛋白质合成，因此这一假设需谨慎看待。当饲料干物质中葡萄酚类物质添加量达到约3%（GP-high和EXT）时，可降低饲料蛋白质的降解率，从而进一步抑制氨的生成。然而，氨的抑制效应无法通过本研究中观察到的微生物变化来解释或关联。

本研究发现，EXT对不同分类水平的相对丰度有强烈的（通常是负面的）影响；尽管GP-high的效应比其他GS和GP-low处理组更频繁，但与EXT相比，其效应更弱且更少。然而，在与氮代谢相关的功能水平上，EXT和GP-high表现出相似的效应。值得注意的是，正如现有综述所总结的，关于饲喂酿酒副产物降低氨浓度的效应，不同研究结果并不一致，这可能与各研究的饲料因素差异有关。本研究表明，当使用瘤胃可降解蛋白质含量高的饲料来源时，酿酒副产物可作为一种饲料选择。

本研究数据表明，高剂量葡萄酚类物质会影响瘤胃碳水化合物的发酵。具体而言，EXT和GP-high以降低丁酸为代价提高了乙酸含量，这与我们以往的研究结果一致——该研究发现，在干酒糟及其可溶物中添加葡萄渣也有类似效应。本研究中，所有GS和GP处理组的中性洗涤纤维（NDF）含量均较高，而中性洗涤纤维会促进乙酸生成。然而，仅GP-high和EXT（两者提供的酚类物质含量均约为饲料干物质的3%）改变了挥发性脂肪酸（VFA）谱，这表明影响挥发性脂肪酸通路的并非酿酒副产物中的纤维，而是高剂量的酚类物质。

葡萄酚类物质可能通过调节氮代谢影响挥发性脂肪酸谱，因为氨基酸可通过脱氨作用生成挥发性脂肪酸、二氧化碳（CO₂）和氨。与此一致的是，EXT和GP-high均降低了奇数和支链短链脂肪酸的比例，而这些脂肪酸是支链氨基酸氧化脱氨的产物。需注意的是，使用副产物时，饲料木质素含量的增加也应被考虑。本研究数据显示，与添加葡萄籽粕相比，添加葡萄渣降低了纤维降解率。葡萄渣由葡萄浆果的果梗、果皮和种子组成，其中果梗含有木质素，这可能是导致上述结果的原因。

结合网络分析和处理组诱导的微生物群数据，可识别出一些参与碳水化合物和蛋白质发酵、并可能导致乙酸和丁酸变化的关键微生物。EXT和GP-high均提高了瘤胃杆菌属（Ruminobacter）的丰度，该属可产生琥珀酸、乙酸和甲酸[38]；相反，这两种处理均降低了厌氧棍状菌属（Anaerostipes）和Olsenella属的丰度。Olsenella属是本研究样品中丰度排名前十的核心微生物群之一，网络分析显示该属与多个丁酸生成相关通路呈极高相关，包括琥珀酸发酵生成丁酸（PWY-5677）、乙酰辅酶A发酵生成丁酸（PWY-5676）、L-赖氨酸发酵生成乙酸、丁酸和氨（P163-PWY）以及4-氨基丁酸降解途径V（生成丁酸，PWY-5022）。已有研究报道Olsenella属与反刍动物的饲料效率相关，但不同研究结果存在争议。厌氧棍状菌属（Anaerostipes）可通过葡萄糖主要生成乙酸、乳酸和丁酸。需注意的是，GP-low也降低了厌氧棍状菌属（Anaerostipes）的丰度并提高了瘤胃杆菌属（Ruminobacter）的丰度，但并未影响挥发性脂肪酸组成。

在种水平上，本研究数据显示，EXT显著降低了产丁酸菌种纤维分解丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）和产琥珀酸瘤胃螺旋体布氏密螺旋体（Treponema bryantii）的丰度；相反，EXT和GP-high均提高了产琥珀酸纤维杆菌琥珀酸亚种（Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes）的丰度，该瘤胃纤维分解菌可产生乙酸和琥珀酸。EXT还提高了部分普雷沃氏菌属（Prevotella）细菌的丰度，这表明这些瘤胃细菌可耐受葡萄酚类物质，并可能在与其他敏感菌种的竞争中占据优势。总体而言，与GP-high相比，EXT导致瘤胃细菌组成发生更大变化，但在功能水平上，两种处理的效应相当。这似乎表明，少数微生物的变化可能足以推动挥发性脂肪酸（VFA）生成的改变。

与以往研究结果不同，本研究中所有处理组均未对甲烷生成产生影响。处理组对甲烷无影响的结果与观察到的挥发性脂肪酸谱一致，即丙酸生成未受影响，而乙酸的效应被丁酸抵消。乙酸和丁酸的生成会产生氢，这些氢随后用于甲烷生成。以往的一项荟萃分析表明，饲料中性洗涤纤维（NDF）含量可抵消生物活性化合物剂量对甲烷相关变量的影响，这可能支持本研究中GS和GP处理组的结果，但无法解释EXT对甲烷生成无影响的现象。

类黄酮可通过其他途径影响甲烷生成，如作为氢汇和抑制产甲烷菌。本研究中，EXT降低了甲烷球形菌属（Methanosphaera）和甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）的丰度，但未影响甲烷生成。然而，古菌的系统发育可能无法预测其活性，其他微生物（如厌氧真菌和细菌）的丰度可能影响更大。葡萄酚类物质缓解甲烷生成的潜力可能与特定活性化合物（如原花青素）的水平和补充方式有关。例如，在体外添加纯化形式的葡萄原花青素可显著降低甲烷生成。此前，我们发现当饲料中添加5%葡萄籽粕并与干酒糟及其可溶物混合时，可观察到甲烷缓解效应。因此，评估生物活性化合物与饲料成分的紧密接触是否能刺激其对瘤胃甲烷生成的抑制作用具有重要意义。

葡萄籽中的多酚浓度高于葡萄藤的其他部分，但花青素除外——花青素主要存在于红酒葡萄的果皮中。尽管本研究中使用的葡萄渣和葡萄籽粕的总酚含量和抗氧化能力相似，但它们的酚类物质谱可能不同。然而，对于酚类物质含量相似的处理组（如EXT与GP-high、GS-high与GP-low），其对瘤胃发酵的效应一致或无效应，这表明葡萄酚类物质的剂量在调节瘤胃发酵特性方面起主导作用。

结论

本研究结果表明，葡萄渣和葡萄籽粕可添加到牛饲料中，添加量最高可达饲料干物质的20%，且不会显著降低瘤胃发酵水平。此外，葡萄酚类物质具有调节瘤胃氮代谢的功能效应，可降低氨生成。因此，建议将葡萄和酿酒副产物与高易消化蛋白质含量的饲料成分搭配使用。在影响瘤胃功能方面，葡萄酚类物质的剂量比其形式或来源更具主导作用。向饲料干物质中添加3%的葡萄酚类物质是一种有效的剂量，且瘤胃微生物群可耐受该剂量。

建议在动物试验中验证该推荐剂量，同时考虑动物对饲料的接受度以及接触生物活性化合物后的上皮反应。本体外研究展示了利用常见食品工业副产物（作为多酚来源）作为反刍动物功能性饲料的潜力。然而，体外研究结果未涉及宿主相关因素的影响，因此观察到的结果需在未来研究中进一步验证。