《食品科学》：朱保庆教授、程金新副教授：基于全基因组重测序的赤霞珠葡萄插入缺失标记开发及其在葡萄酒真实性鉴定中的初步验证

葡萄（Vitis vinifera L.）是一种双子叶植物，属于葡萄科（Vitaceae）、葡萄属（Vitis）。赤霞珠葡萄是最广泛种植的红葡萄品种，也是世界上主要的酿酒品种之一。随着消费者需求的增长及葡萄酒经济价值的提升，葡萄原料混用、标签错贴、以劣掺优等现象层出不穷，引发葡萄酒品质下降、消费者权益受损、消费市场停滞等一系列问题。葡萄酒质量受原料品种、产区和酿酒工艺等因素影响，而决定葡萄酒质量和风格特征的主要因素是原料品种。因此，对葡萄品种真实性的准确识别是打击欺诈行为和确保商业公平的关键。

全球葡萄种质资源丰富，研究发现DNA分子标记可准确鉴定葡萄品种及异株。分子标记方法是一种研究基因组信息的有效手段，它能够检测和追踪来自父母本的遗传变异，具有数量多、多态性高、重复性强和稳定性好的优势，在标记辅助育种和品种鉴定中起着至关重要的作用。

InDel标记因其密度大、特异性高、通用性强和重现性好等优势，已成为国内外学者的研究热点。InDel标记是根据同一物种不同个体之间基因组的插入/缺失位点而设计的多态性引物，它在基因组内分布和密度仅次于SNP。目前，InDel标记已被应用于葡萄品种的鉴定。由于葡萄酒原料富含多酚、多糖等杂质，且生产中的发酵、陈酿、澄清和过滤等步骤会破坏葡萄DNA，所以葡萄酒中的葡萄DNA不易提取。目前，葡萄酒的真伪和品质的InDel分子鉴定仍是难题。

中国人民警察大学侦查学院的孙倩、程金新*，北京林业大学森林食品与健康研究院的朱保庆*等人研究利用16 种常见的酿酒葡萄基因组遗传信息，挖掘出在品种间具有差异的基因组InDel标记，并将它们应用于赤霞珠葡萄酒真实性的初步鉴定中，旨在为葡萄品种间分子标记开发和品种鉴定提供参考。

1 赤霞珠葡萄基因组InDel标记开发和得选

本研究对基因组InDel标记进行了开发和得选（图1A）。11 个常见酿酒红葡萄品种样本DNA浓度、纯度及凝胶电泳的检测结果表明，提取的样本DNA纯净、主带清晰且完整性良好，DNA质量符合构建测序文库的要求。测序共产生原始数据量321.6 Gb，平均每个样品14 969.018 Mb，过滤后数据量共318.8 Gb，平均每个样本14 838.691 Mb，每个品种均获得了超过10 Gb的原始数据量。碱基错误率仅占0.03%，Q20（Phred数值大于20的碱基占总体碱基的百分比）为96.74%～98.16%，Q30（Phred数值大于30的碱基占总体碱基的百分比）范围为89.64%～94.05%（图1D）。通过分析11 个测序样本的基因组测序数据，共得选到676 个基因组候选InDel标记，全部标记可以根据得选方法分为两大类，第1类表示6 个赤霞珠样本有1 条染色体与赤霞珠单倍染色体基因组Cab08（Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 08 v1.1）相同，其他品种的样本与参考基因组完全相同或完全不同，该类共计128 个，包括70 个赤霞珠缺失型标记和58 个赤霞珠插入型标记；第2类表示6 个赤霞珠样本的2 条染色体和参考基因组完全相同，其他品种的2 条染色体在该位点上的基因型和参考组至少有1 条不同，该类共计548 个，包括271 个赤霞珠缺失型标记和277 个赤霞珠插入型标记。本实验最终获得了341 个赤霞珠缺失标记和335 个赤霞珠插入标记（图1B）。通过InDel标记在染色体上的分布情况统计可知，InDel标记在染色体上的分布不均，其中45.11%的InDel主要分布在染色体ch04、ch10和ch14上（图1C）。本研究从676 个InDel标记中选择长度大于10 bp的InDel标记，共得选出35 个赤霞珠缺失型InDel标记和28 个赤霞珠插入型InDel标记。

 

 

2 InDel标记在葡萄叶片体系中的验证

2.1 引物设和有效性引物得选

在35 个赤霞珠缺失型和28 个赤霞珠插入型InDel标记中，有6 个赤霞珠缺失型InDel标记（Del-1～6）和7 个赤霞珠插入型InDel标记（In-1～7）成功设计出了引物（表2）。通过对上述13 对基因组InDel引物的得选，排除了扩增效果差的In-2和In-6引物（图2A），保留扩增效果较好的6 对赤霞珠缺失型InDel标记引物（Del-1～6）及5 对赤霞珠插入型InDel标记引物（In-1、In-3～5、In-7）进行后续实验。

 

 

2.2 琼脂糖凝胶电泳结果

由图2B可知，16 个样本的条带单一明亮，DNA的完整性良好。为探究不同引物在品种间的多态性，本实验利用得选的11 对基因组引物对16 份酿酒葡萄的DNA进行PCR扩增。电泳结果表明，9 对引物（Del-1～6、In-1、In-4～5）的产物长度与预测值一致，In-3和In-7引物的产物长度与预测值不符，因此被排除。

以Del-1为例，赤霞珠（A1～A6）、马瑟兰（B1）、佳丽酿（C3）和黑比诺（C5）品种的条带数目及产物长度与其余品种具有明显差异；Del-2引物扩增出的产物片段能够将赤霞珠（A1～A6）、仙粉黛（C2）、佳丽酿（C3）和黑比诺（C5）品种与其余品种区分开（图2C）。同样地，除In-3和In-7引物外，其他引物的凝胶电泳结果也反映出这些InDel标记在不同品种中具有一定的多态性。

2.3 毛细管电泳扩增结果

为了进一步精确检测PCR产物的大小和上述InDel标记在不同品种间的多态性，本实验进行了毛细管电泳扩增。以Del-1扩增结果为例，赤霞珠（A1～A6）、马瑟兰（B1）、佳丽酿（C3）和黑比诺（C5）这4 个品种的产物长度均为222/303 bp，其余7 个品种的产物长度均为303 bp，该结果与各样本的凝胶电泳扩增结果完全吻合，表明该标记在品种间具有显著多态性，能够区分赤霞珠及其余7 个品种（表3）。同样地，除In-3及In-7外，其余引物的毛细管电泳结果表明每对引物均能区分赤霞珠及其他品种。结果表明，9 个基因组InDel标记（Del-1～6、In-1、In-4、In-5）在品种间具有良好多态性，能够将赤霞珠与特定品种区分（图2D）。此外，能用于区分赤霞珠和马瑟兰的标记有7 个，分别是Del-2～6、In-1和In-5，这可为后续得选能够区分赤霞珠马瑟兰酒的标记提供一定的指引。

3 InDel标记在葡萄酒真实性鉴定中的应用

3.1 发酵葡萄酒DNA提取方法比较和方法优化

为探究葡萄酒DNA的最佳提取方法，比较了磁珠法、CTAB法及SbeadexTM DNA提取试剂盒法对2022年产赤霞珠葡萄酒的DNA提取效果。根据随机选取的3 对引物（Del-1、In-1、In-5）的扩增结果，发现CTAB法明显优于其他2 种方法（图3A），这表明CTAB法在葡萄酒中提取DNA的效果较好。3 种提取方法得到的DNA A_260 nm/A_280 nm在1.436～1.825之间（表4），低于纯净DNA的A_260 nm/A_280 nm（1.8～2.0），表明葡萄酒的DNA较难提取。

 

 

在采用CTAB法提取葡萄酒DNA的基础上，对CTAB法进行了优化，优化范围包括酒样DNA提取前处理过程以及DNA纯化方法。结果表明，加入70%体积异丙醇沉淀后葡萄酒DNA的提取效果更为理想（图3B）。通过调整酒样的洗涤纯化方法，发现相较于乙醇-醋酸铵，利用DNA纯化试剂盒纯化后的酒样DNA扩增效果有了显著提升（图3C）。对比了优化前后的CTAB法，扩增9 个标记引物，结果显示优化后的CTAB法明显提升了酒样DNA的提取效果（图3D）。

3.2 PCR扩增体系优化

为减少葡萄酒中Taq聚合酶抑制剂对PCR结果的影响，对酒样DNA的PCR扩增体系进行了优化。优化范围包括DNA模板量和引物添加量。以赤霞珠酒样DNA为模板、Del-5为引物，对上述2 个优化范围分别进行单因素试验。在20 μL的扩增体系中，梯度DNA模板量为0、2、4、6、8 μL。当DNA模板量为4 μL时，酒样DNA扩增效果较好。在确定最适DNA模板添加量后，进一步设置引物添加量为0、0.5、1、1.5、2 μL。结果表明，当正反引物各1 μL时DNA扩增效果较好。

3.3InDel标记在赤霞珠和马瑟兰酒中的扩增结果

为验证上述9 个InDel标记是否能稳定应用于葡萄酒品种的鉴定，本实验以2022年生产的赤霞珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒为例并对其进行分析。如图4所示，这些InDel标记在马瑟兰葡萄酒的扩增结果优于赤霞珠酒。在赤霞珠葡萄酒DNA中，有3 个标记被扩增出来，分别是Del-2、Del-4和Del-6；在马瑟兰葡萄酒DNA中，有8 个标记被扩增出来，分别是Del-1～6及In-4～5。可以作为鉴定赤霞珠和马瑟兰酒样的候选标记为Del-2、Del-4和Del-6。其中，Del-2标记在赤霞珠葡萄酒中的扩增结果为2 个条带，而在马瑟兰葡萄酒中的扩增结果为1 个条带，扩增条带数和产物扩增长度均与InDel在2 种葡萄品种的毛细管电泳结果相印证。Del-4和Del-6在赤霞珠葡萄酒中的扩增结果均为1 个条带，而在马瑟兰葡萄酒中的扩增结果则为2 个条带，扩增条带数和产物扩增长度与其在葡萄品种中的扩增结果相符合。

 

综上，Del-2、Del-4和Del-6这3 个InDel标记在赤霞珠和马瑟兰酒中表现出显著的多态性，可作为品种鉴定的候选标记。将这3 个标记联合应用，不仅能够判断葡萄酒是否由单一的赤霞珠或马瑟兰品种酿制，还可以鉴别赤霞珠和马瑟兰葡萄酒是否相互混合，具有重要的应用价值。

讨论

是否由单一的赤霞珠或马瑟兰品种酿制，还可以鉴别赤霞珠和马瑟兰葡萄酒是否相互混合，具有重要的应用价值葡萄种质资源的精准鉴定是遗传多样性保护和葡萄酒真实性溯源的核心基础。本研究基于赤霞珠全基因组重测序数据，成功得选出9 个高多态性InDel标记（Del-1～6、In-1、In-4、In-5），并构建了一套适用于赤霞珠等品种的分子鉴定体系。Wang Fuqiang等通过KASP标记技术也构建了一套葡萄品种分子鉴定体系。本研究结果证实了使用InDel标记对葡萄进行品种鉴定的实用性，这可能与InDel标记具有快捷方便及易于低成本基因分型等优势有关。与Zhu Junchi等基于高通量测序及全基因组酶切位点的简化基因组测序技术开发的SNP/InDel遗传图谱相比，本研究通过常规PCR扩增结合毛细管电泳分型，显著降低了技术复杂性和成本，同时避免了SNP标记依赖KASP平台或测序的局限性。例如，王富强等利用22 个KASP标记区分76 个葡萄品种，但其分型设备要求较高，这在一定程度上限制了其广泛应用；而本研究的InDel标记仅需通过引物长度差异即可实现共显性检测，在16 份葡萄样本中表现出更高的分辨率和稳定性。

葡萄酒中优质葡萄DNA的获得是进行任何葡萄酒品种鉴定的基础，同时也是目前研究领域中面临的关键技术难题。CTAB法是一种广泛应用于植物样本中DNA提取的方法，已有多项研究表明其对于葡萄和葡萄酒的提取效果较佳，本研究也得到类似结果。这可能是因为相较于其他方法，CTAB法对酚类和多糖杂质的去除效果更佳。值得注意的是，本研究中3 种提取方法所获取的酒样DNA并不纯净，或许是由于样品含有较多的杂质所致。有研究表明，经过优化的CTAB法能够降低样品中杂质对葡萄酒DNA提取的影响。为此，本实验对CTAB法进行了优化，发现在酒样中加入70%体积异丙醇并结合纯化能够更好地提升酒样DNA的扩增效果。这与Öner等的研究结果一致，他们通过添加3%聚乙烯吡咯烷酮-40和65 ℃预热提取缓冲液优化CTAB法，显著提升了DNA提取效率。Agrimonti等发现，将CTAB法与NucleoSpin植物试剂盒纯化相结合可以提升葡萄酒DNA的提取效率，实现葡萄品种在生产链中的真实性追踪。

已有研究多聚焦于SNP和SSR标记在葡萄酒真实性鉴定中的应用，但尚鲜有报道利用InDel标记鉴定不同葡萄酒。Boccacci等开发了用于鉴定“Nebbiolo”葡萄酒的SNP，并提出了一种基于SNP-TaqMan®分析的方法，以评估该品种在葡萄酒中的可追溯性，使用SNP_15082和SNP_14783这2 个标记足以将“Nebbiolo”与1 100多种基因型区分开。本研究首次将InDel标记应用于葡萄酒的真实性鉴定中，发现3 个InDel标记（Del-2、Del-4、Del-6）能够成功鉴定出赤霞珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒，表明该标记法的鉴定效率比较理想。这可能是因为使用凝胶电泳可以轻松检测InDel标记物，且遗传稳定性较好，使得InDel标记在葡萄酒的真实性鉴定中具有一定潜力。需要指出的是，本研究以赤霞珠和马瑟兰作为典型品种，主要聚焦于验证InDel标记在葡萄酒鉴定中的技术可行性，因此尚未评估不同样本、陈酿年份及加工工艺对标记稳定性的影响。未来研究应进一步探讨上述因素对标记稳定性的影响，同时建立覆盖主要产区的葡萄酒DNA标准品库，并开发多标记联合检测算法以提升鉴别精度。

结论

本研究探本研究得选出可用于赤霞珠葡萄品种鉴定的9 个InDel标记（Del-1～6、In-1、In-4、In-5）。构建并优化了葡萄酒DNA提取方法和PCR扩增体系，将上述9 个InDel标记初步应用于赤霞珠葡萄酒鉴定体系中，发现3 个关键InDel标记（Del-2、Del-4、Del-6）可以区分赤霞珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒。上述结果可以为葡萄酒真实性的鉴定提供新的技术路径，同时为赤霞珠葡萄酒的质量和真实性控制以及原产地保护提供重要的参考价值。未来研究可致力于开发抗酚类干扰的DNA纯化技术、构建多产区InDel标记数据库以及建立混合品种葡萄酒的定量鉴别模型。本方法的推广应用将有助于完善葡萄酒质量追溯体系，保障行业健康发展。

作者简介

通信作者：

程金新，女，中国人民警察大学侦查学院食品药品犯罪侦查（核生化消防）教研室主任、副教授，硕士研究生导师，主要从事与食品药品犯罪侦查、核生化灾害事故应急救援相关的教学及科研工作。主持或参与国家、省部级教学科研项目11 项；主编或参编专业教材、著作8 部。发表相关学术论文20余篇。荣立三等功1 次，校级优秀教师，优秀党员。

朱保庆，男，1982 年生人，博士，北京林业大学生物科学与技术学院教授，博士生导师。兼任中国食品工业协会葡萄酒果酒国家级评委、中国经济林协会加工利用分会副秘书长、中国酒业协会果酒技术委员会委员、北京市食品学会理事、北京市园林绿化局专家工作站站长等。主要研究领域包括：（1）经济林果及其加工制品品质形成机制研究；（2）食品风味化学与感官评价。近年主持国家自然科学基金、北京市自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金等10余项纵向科研项目及18项企业横向委托合作项目，在国内外学术期刊发表论文90余篇，授权国家发明专利2 件，软件著作权2 项，参译学术专著2 部，参编研究生用教材1 本。作为主要参与人曾获中国食品工业协会科学技术特等奖、中国商业联合会科技进步一等奖、梁希林业科技进步二等奖以及北京林业大学家骐云龙青年教师教学优秀奖和北京林业大学科技之星等荣誉称号。

第一作者：

孙倩，女，汉族，北京林业大学生物科学与技术学院2022级硕士研究生，攻读食品加工与安全专业硕士研究生学位，研究方向为食品生物技术。

本文《基于全基因组重测序的赤霞珠葡萄插入缺失标记开发及其在葡萄酒真实性鉴定中的初步验证》来源于《食品科学》2025年46卷第18期92-101页，作者：孙倩，李娜，杨冰艺，王杰，王晓楠，薄文浩，邢冉冉，程新*，朱保庆*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250121-153。