PLANT PHYSIOL BIOCH：蔗糖合成酶3提升葡萄果实品质

蔗糖合成酶3提升葡萄果实品质

期刊：Plant Physiology and Biochemistry（5.7）

发表日期：2025年02月04日

研究背景

糖类是植物生命活动的基本物质，作为能量材料和信号分子，调节果实的甜味、成熟和应激反应等多种生理过程。它们是合成水果中其他营养物质和风味化合物的前体，如类胡萝卜素、维生素、花青素、淀粉和香气。其中，糖的成分和含量在决定水果品质。水果中糖分的积累主要由两个因素决定：“来源”和“沉淀”。果实中的蔗糖合成酶（SS）调节蔗糖的合成和分解，维持了合成器官与韧皮部之间的蔗糖平衡。作为植物中蔗糖代谢的关键酶之一，SS与其他蔗糖代谢相关酶如SPS和INV不同，其独特能力是催化蔗糖代谢的可逆反应。重要的是，SS几乎能催化蔗糖的合成和分解而不消耗能量，使蔗糖能够快速从“汇”转化为“源”，而无需其他酶的介入。大量研究表明，果实发育中蔗糖的积累与SS基因表达水平及SS酶活性的增加密切相关。SS基因在果实蔗糖代谢和果实发育中起着重要作用。

SS蛋白有两个磷酸化位点，分别位于丝氨酸磷酸化位点11–15和170附近，主要参与膜结合和蛋白质降解调控。蛋白质磷酸化还能改变细胞内蛋白质的定位、稳定性及相互作用。该过程主要由蛋白激酶催化，将磷酸基团从ATP转移到底物蛋白的氨基酸残基，如丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）。研究表明，SS的功能和蛋白质活性受上游蛋白激酶调控。SS活性与SnRK1之间存在密切关系。众所周知，在非跃变果实中，ABA在果实成熟过程中起着关键作用。在植物、蔗糖和ABA中，存在ABA和蔗糖之间的相互作用，SnRK1可以被ABA和蔗糖调控（Jossier等，2009）。

葡萄果实中的糖分含量决定了果实的风味和品质，SS基因在果糖代谢途径中的作用对于提升葡萄果实品质至关重要。在我们之前的研究中，我们展示了VvSnRK1β与VvSS3之间的相互作用。进一步分析了VvSS3对葡萄果发育和成熟的调控机制。对VvSS3进行了定点诱变，以鉴定VvSS3与VvSnRK1β的关键结合位点。同时，对VvSS3及其突变序列进行了过表达，以研究VvSS3调控果实成熟的分子机制及突变位点对VvSS3功能的影响。

研究结果

2.1 VvSS3的生物信息分析

生物信息分析在支持信息中完成（见图S1–S3）。VvSS蛋白的保守结构域与PLN00142家族匹配，包含植物SS家族特异性的蔗糖合酶（Sucrose_synth）结构域和糖基转移酶（glycos_transf_1）结构域（见图S4A）。系统发育树分析表明，VvSS3与无花果、拟南芥和枣的氨基酸同源性分别为84.96%、79.34%和86.26%，而与马铃薯则有远缘同源（见图S4B）。利用MEME在线工具对17个物种的SS氨基酸序列基序结构进行进一步分析，发现了10个保守基序。每个物种基序的排列和大小高度相似，表明这些物种SS蛋白的结构和功能具有高度的保守性（见图S4C）。

2.2 葡萄果发育过程中VvSS3的表达和酸代谢

我们从不同葡萄组织中分离出总RNA，以测量VvSS3基因表达（图1A），结果显示VvSS3在幼茎、花和果实中相对较高，而根和叶片中相对较低（图1B）。葡萄中主要的有机酸成分是酒石酸和苹果酸，柠檬酸含量非常低。柠檬酸在坐果和膨大阶段仅有少量存在，而在转色和成熟阶段其含量几乎可以忽略不计。随着果实成熟，有机酸含量下降，坐果和膨大阶段有机酸含量较高。在早期转色阶段，随着糖的快速积累，有机酸含量迅速下降，呈现出与可溶性糖积累相反的趋势（见图1C）。

2.3 ABA对VvSS3表达和糖代谢的影响

为了探究VvSS3是否能对ABA处理产生反应，从而影响葡萄水果中的糖代谢，我们分析了VvSS3的表达和糖代谢。结果显示，与CK相比，ABA加速了果实着色（见图2A），ABA浓度越高，果实着色越快。ABA处理组的花青素含量显著高于CK组，且随着ABA浓度的增加，花青素含量也随之增加（图2B）。三组ABA处理后葡萄果的葡萄糖和果糖含量显著高于CK组，且ABA处理显著提高了水果中可溶性糖的积累速率和含量，其中T3组处理效果最佳。葡萄糖和果糖含量在果实完全成熟时达到最高水平（见图2C）。与此同时，ABA处理有效降低了水果中的有机酸含量（见图2D）。在不同ABA浓度下，SS的酶活性主要保持在分解方向，随着外源ABA浓度的增加，特别是在S5期间，各处理组的SS活性总体趋势有所上升，100 mg/L ABA治疗后合成方向活性提升了49.6%，分解方向活性提升了24.5%。

2.4 ABA在葡萄发育过程中改变了SS酶的活性

葡萄果实发育过程中SS酶活性的变化与VvSS3基因的表达模式相似，葡萄SS在分解方向上比合成方向大。在S1期间，酶在SS分解和合成方向的活性均较低。在S2期间，蔗糖合酶活性迅速增加。在随后的转色和成熟阶段，葡萄生长波动缓慢，但整体呈上升趋势（见图3A和B），在果实完全成熟时达到最高活跃度。在S2膨大期，ABA对SS的合成和分解方向有轻微抑制作用，但随着葡萄果的发育，ABA对SS酶活性的抑制作用逐渐减弱，显著增强了SS分解和合成方向活性（图3A和B）。

2.5 ABA调控VvSS3和糖酸代谢基因

为了探讨外源性ABA处理对葡萄中VvSS3表达的影响，采用了ABA来处理葡萄。结果显示，不同ABA浓度显著促进VvSS3的表达，低浓度ABA时VvSnRK1s增加，但高浓度ABA抑制。随后检测到果糖（VvSPS、VvCWINV、VvNI）、酸（VvIDH、VvMDH、VvPEPC）代谢相关基因。ABA处理提高了糖类相关基因的表达，ABA处理与果实葡萄糖代谢密切相关，VvSS3和葡萄糖代谢相关基因被ABA正向诱导，而酸代谢相关基因VvIDH和VvPEPC的表达主要由ABA降低（见图S5)。假设ABA通过在糖合成过程中诱导下游结构基因的表达，促进水果中可溶性糖的积累。

2.6 VvSS3与VvSnRK1β互作

在我们之前的研究中，我们表明 VvSS3 可以与 VvSnRK1β相互作用。为了进一步分析VvSS3蛋白与VvSnRK1β相互作用的关键结合位点，分析了三组VvSS3突变序列（丝氨酸突变为丙氨酸，VvSS3Ser167-BD，VvSS3Ser176-BD，VvSS3Ser381-BD）被用来与VvSnRK1β-AD相互作用。结果显示，只有VvSS3Ser167与VvSnRK1β相互作用（图4A），并由BiFC确认VvSS3+VvSnRK1β和VvSS3中观察到荧光信号Ser167+VvSnRK1β（图4B）。这些研究表明Ser176和Ser381可能是VvSS3与VvSnRK1β相互作用的关键结合位点。

2.7 位点突变体未改变VvSS3亚细胞定位

为了理解VvSS3蛋白在植物细胞中的定位，构建了带有绿色荧光标签的pRI101-VvSS3-GFP重组载体，转化为GV3101农杆菌，并注射到烟草叶中以观察荧光信号。结果显示，叶片下方表皮细胞的细胞膜上观察到荧光信号（见图5），表明pRI101-VvSS3-GFP， pRI101-VvSS3Ser176-GFP和pRI101-VvSS3Ser381GFP定位于细胞膜上，VvSS3在这两个关键结合位点的位点突变不会影响VvSS3蛋白在细胞中的分布。

2.8 VvSS3在草莓水果中的瞬时表达

为了进一步探讨VvSS3对植物果实葡萄糖代谢的影响，VvSS3-O和pRI101空载体在草莓果实大绿果阶段短暂表达。首先，我们证明了VvSS3也与FaSnRK1β相互作用，因此，类似葡萄的功能，VvSS3也与FaSnRK1β在草莓中协同工作（见图S6）。VvSS3过度表达的草莓果实逐渐完全成熟，但两组草莓的颜色存在差异。第三天，VvSS3-O组的草莓着色速度明显快于CK组，果实表面开始在大范围内变色，而CK组仅部分区域略带颜色，注射6天后，两组表面完全着色，VvSS3-O的着色比CK更深（见图6）。这些研究表明VvSS3促进了果实着色。

2.9 VvSS3改变葡萄糖代谢

VvSS3-O果实用于糖代谢基因表达，结果显示VvSS3-O草莓中的可溶糖含量增加，果糖含量显著增加，柠檬酸含量降低了12%（见图7A和B）。同时，VvSS3-O组的总花青素含量高于CK（见图7C和D），这与FaCHS、FaCHI、FaF3H和FaDFR等花青素代谢相关基因表达一致。与葡萄糖代谢和合成途径相关的基因表达水平在VvSS3-O和VvSS3中均有所提升（图7D）。这些研究表明，VvSS3增加了草莓果实中的可溶性糖分含量，从而加速果实的着色，最终加速果实成熟。

2.10 葡萄愈伤中过表达VvSS3

为了分析VvSS3的生物功能及其在ABA调控作用中的参与，以及ABA对VvSS3和VvSnRK1β表达的直接遗传学证据，这两种磷酸化位点突变载体VvSS3S176-pRI101，VvSS3S381-pRI101被转化为“佳美”葡萄愈伤（见图S7）。结果显示，与CK相比，VvSS3-O的表达水平增加了2倍，VvSS3增加了2.4倍S176-O 和 VvSS3 中的 1.8 倍S381-O，分别（见图8）。GFP 荧光信号也在不同的转基因牛蹄中检测到，表明VvSS3在“佳美”葡萄愈伤中成功过度表达。

2.11 VvSS3促进糖分积累

通过检测SS在VvSS3-O，VvSS3S176-O，VvSS3S381-O中的酶活性，研究发现，与CK相比，VvSS3-O在合成和分解方向上的酶活性增加了28.3%，而VvSS3的分解方向活性则提升了28.3%。VvSS3S176-O和VvSS3S381-O也显著增加，分别为66.3%和12%，但合成方向酶活性分别下降36.6%和45.9%（图9A）。可溶性糖积累被促进（见图9B），VvAI，VvSS3S176-O和VvSS3S381-O显著提高了葡萄糖代谢相关基因VvCWINV、VvSPS和VvNI的表达水平（图9C）。酸成分含量减少（见图9D），酸成分相关基因VvMDH、VvPEPC和VvIDH显著低于CK基因（见图9E）。

2.12 VvSS3促进了葡萄愈伤中的花青素积累

对VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O这三种转基因愈伤组织的表型观察显示，与对照组相比，VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O的愈伤组织颜色明显加深（图 10A）。为了更准确地评估不同转基因愈伤组织的颜色差异，还测量了花青素含量，花青素含量的结果与表型观察结果一致（图 10B）。同时，与对照组相比，VvSS3-O及其两个突变转基因愈伤组织中 VvPAL、VvCHS、VvUFGT和VvLDOX的表达显著上调（图 10C），这表明VvSS3通过上调花青素合成途径相关基因的表达来调控葡萄愈伤组织中的花青素合成。

2.13 VvSS3影响了葡萄愈伤中的ABA含量

研究表明，适当浓度的脱落酸能够通过调节与蔗糖代谢相关的酶的活性以及生物合成基因的表达来影响蔗糖代谢。为了进一步分析VvSS3所介导的生物学功能，我们检测了脱落酸代谢基因的表达情况。结果表明，与对照组相比，VvSS3S176-O和VvSS3S381-O转基因愈伤组织中的内源性脱落酸含量显著增加，尤其是VvSS3-O和VvSS3S176-O，分别增加了27.58%和34.09%（图 11A）。VvPYL1、VvNCED1、VvZEP和VvPP2C的表达水平显著上调（图 11B）。这些结果表明，VvSS3 能够影响脱落酸及其参与果实发育的信号通路。

2.14 VvSS3对ABA的敏感性

为了明确VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O的基因功能，我们对不同浓度的ABA（0、25、50、75、100μM）进行了转基因愈伤组织的接种，然后在培养15天后观察愈伤组织的生长情况。结果表明，与对照组（CK）相比，含有ABA的培养基中转基因愈伤组织VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O的生长速度减慢，并且随着ABA浓度的增加这种现象变得更加明显（图 12A），这表明VvSS3的过表达导致葡萄愈伤组织对ABA更敏感。

为了测试VvSS3是否由ABA诱导，我们在不同浓度的ABA条件下检测了VvSS3的基因表达和酶活性。结果表明，在CK条件下，VvSS3的表达随着ABA浓度的增加而增加，尤其是在转基因愈伤组织VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O中（图12 B）。同时，在0μM的ABA条件下，VvSS3-O的合成和分解方向的酶活性增加，而VvSS3S176-O和VvSS3S381-O在分解方向的酶活性增加。活性虽然在合成方向上出现了显著下降，但在经过ABA处理后，该酶在合成方向上的活性逐渐上升，尤其是在VvSS3S381-O中（图12 C）。

2.15 VvSS3影响了VvSnRK1β表达

一些研究表明，SnRK1作为一种蛋白激酶，通过磷酸化下游蛋白质来间接调控植物的糖代谢，并在调节花青素的积累方面发挥着重要作用。这些结果表明，VvSnRK1β和VvSS3可能共同通过形成蛋白质复合物来调节葡萄果实中可溶性糖的合成。为了检测VvSnRK1β在由VvSS3介导的葡萄糖代谢途径中的作用，检测了VvSnRK1β在VvSS3-O、VvSS3S176-O和VvSS3S381-O转基因愈伤组织中的表达情况。结果表明，VvSnRK1β在VvSS3-O转基因愈伤组织中的表达显著增加，且与VvSS3呈正相关，这表明VvSnRK1β参与了由VvSS3介导的可溶性糖和花青素的积累过程。然而，在VvSS3S176-O和VvSS3S381-O转基因愈伤组织中，VvSnRK1β的表达下调，这表明Ser381和Ser176的两个磷酸化位点影响了VvSnRK1β-VvSS3的信号通路。随后，在用脱落酸处理的转基因愈伤组织中再次检测到了VvSnRK1β的表达。结果发现，脱落酸处理提高了VvSS3-O转基因愈伤组织中VvSnRK1β的表达，并且在高浓度脱落酸条件下，在Ser176和Ser381位点上也有这种上调现象，但在低浓度脱落酸条件下则没有（图 13）。