Food Chemistry-X：应用分子感官科学方法对中国丹菲特葡萄酒中的关键气味活性化合物及其地区差异进行表征

应用分子感官科学方法对中国丹菲特葡萄酒中的关键气味活性化合物及其地区差异进行表征

期刊：Food Chemistry: X（6.1）

发表时间：2023.2

 

研究背景

丹菲特（Vitis vinifera L.）是一个起源于德国的新红葡萄品种，它是Helfensteiner（V. vinifera L.）和Heroldrebe（V. vinifera L.）的杂交种。用丹菲特酿造的葡萄酒被公认为具有中等单宁、中等酸度和丰富的香气。许多研究人员关注其在丹菲特葡萄酒中的蛋白质成分、多酚氧化酶、酚类化合物和颜色质量。同时，由于丹菲特葡萄酒具有明显的典型香气，对其香气特征和气味活性化合物的研究也越来越受到重视。

21世纪初，丹菲特被引入中国，并呈现出良好的适应性。随着种植面积的扩大，它已经在中国多个地区种植，如天山北麓、贺兰山东麓、胶东半岛等地区。地区气候、土壤、地质、管理措施的多样性，以及相互作用，可以为葡萄和葡萄酒带来特殊的风格。亟需对中国丹菲特葡萄酒的香气特征的区域变化以及其关键气味活性化合物的感官贡献进行综合分析。

随着分子感官科学的发展，即"感官组学"方法被认为是一种在分子水平上研究食品感官质量的多学科综合技术，对葡萄酒中气味活性化合物的研究以及它们之间的相互作用变得更加深入和彻底。更具体地说，GC-O结合香气提取稀释分析（AEDA）被广泛用于通过计算风味稀释（FD）来识别关键的气味活性化合物，然后通过香气重组和省略测试来验证关键挥发性化合物对整体香气的贡献。一些快速描述性的感官方法也已经出现，以补充感官研究的不足，如Napping、Flash profile（FP）、Pivot© profile（PP）、Check-all-that-apply（CATA）和Rate-all-that-apply（RATA）。其中，CATA被广泛用于研究葡萄酒的颜色、香气和味道，向评价者提供一个感官词汇表，以选择适用于样本的所有术语。传统的"感官组学"方法与快速描述性感官方法的结合可以展示出对葡萄酒香气特征更全面的分析。

在这项研究中，我们研究了来自中国三个优质地区--天山北麓、贺兰山东麓和胶东半岛的丹菲特葡萄酒的香气特征。通过AEDA-GC-O/质谱法（MS）和气味活性值（OAVs）的分析，鉴定了丹菲特葡萄酒中的气味活性化合物。结合感官分析，揭示了三个地区的风土条件对丹菲特葡萄酒香气的影响。此外，通过重组和省略测试，研究了关键气味活性化合物的感官贡献和相互作用。

材料和方法

1. 葡萄酒样品

来自新疆昌吉、宁夏银川和山东烟台的三个酒庄在2020年酿造了三款单品种丹菲特葡萄酒、分别属于天山北麓（NFTM）、贺兰山东麓（EFHM）和胶东半岛（JP）产区。

2. 气相色谱-嗅闻/质谱分析(GC-O/MS)

2.1. 挥发提取

采用液-液萃取（LLE）结合溶剂辅助风味蒸发（SAFE）蒸馏法提取香气化合物。

2.2. 香气提取稀释分析（AEDA）

将浓缩的香气化合物提取液用二氯甲烷按比例逐渐稀释，并分别用GC-O/MS进行分析。FD系数被定义为至少有两个或两个以上的评委仍能感知到气味的最大稀释度。

2.3. GC-O/MS条件

GC-O/MS分析使用Agilent 7890B气相色谱仪，配合Agilent 5975C质谱仪和嗅觉检测端口（ODP），在HP-INNOWAX毛细管柱上进行。

3. 芳香化合物的检测和定量

3.1. 固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法(SPE-GC-QqQ-MS/MS)

采用针对性的SPE-GC-QqQ-MS/MS方法，稍加修改，提取并定量测定了甲硫醇、甲硫酚、丁内酯、反式威士忌内酯、γ-壬内酯、愈创木酚、丁香酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-丙基愈创木酚、香兰素和异戊烯醇。

3.2. 顶空固相微萃取-GC-MS（HS-SPME-GC-MS） 

其他香气化合物，主要包括酯类、高级醇类、萜类和C13-降异戊二烯，用HS-SPME-GC-MS方法进行提取和定量。质谱条件与GC-O/MS的条件相同。

4. 感官分析

4.1. CATA

丹菲特葡萄酒的香气特征通过CATA实验进行了分析。

4.2. 香气重组

通过将61种关键的气味活性化合物溶解在无味的模型酒基质中，分别制备了三种丹菲特葡萄酒（NFTM，EFHM和JP）中的浓度的香气重组（表3）。

4.3. 香气遗漏测试

遗漏模型是通过从完全重组模型中遗漏目标化合物来制备的。完全重组模型和省略模型之间每个属性的强度差异是通过独立样本t检验来评估的。

结果与讨论

1. CATA分析下三个地区的丹菲特葡萄酒具有不同的香气特征

31位小组成员对20个描述词的选择频率进行了整理（表1）。总的来说，黑色水果的总频率最高，其次是紫罗兰、金合欢/紫丁香、红色水果、香料、梅干、蜂蜜和干草，这些被认为是描述中国丹菲特葡萄酒的主要描述词。在小组成员达成一致后，这些描述词也被用于后续的香气强度分析。

在地区差异方面，蜂蜜、香蕉、桃子、蘑菇/土、干草和药材在三个地区的葡萄酒中出现的频率有明显差异（P<0.05），见表1。在胶东半岛（JP）的葡萄酒中，更多的品评小组成员认可对蘑菇/土、干草和药用材料的描述。相反，天山北麓的葡萄酒有更多关于蜂蜜、桃子和香蕉的描述，其次是贺兰山东麓的葡萄酒。在NFTM和EFHM的葡萄酒中，紫罗兰、金合欢/紫丁香和香料的出现频率也较高，这与之前研究中对丹菲特葡萄酒的香气描述一致。通过GC-O分析，进一步研究了三个地区（NFTM，EFHM和JP）的中国丹菲特葡萄酒的香气变化的化学信息。

 

 

2. GC-O分析

根据GC-O分析结果，共检测到59个气味活性区，其中49个气味活性区可以被识别，特别是一些花香和香料区（表2）。根据其来源和化学类别，对FD≥3的芳香化合物进行了进一步的总结和讨论。

 

 

在这些化合物中，萜类化合物主要来自葡萄果实，可以通过酶和微生物的生物作用或发酵过程中的酸性和加热条件下的化学反应产生。在这项研究中，三个萜类化合物（包括芳樟醇、α-松油醇和香叶醇）被鉴定为具有相对高的FD因子（FD≥729）。然而，在他们最近的研究中，在丹菲特果汁和葡萄酒中都发现了芳樟醇。可以推测，中国丹菲特葡萄酒中的萜类化合物可能是上述花香的原因。至于降异戊二烯，β-大马士革酮在所有三种丹菲特葡萄酒中都有很高的FD因子（FD≥729），它主要促成了葡萄酒中的蜂蜜和甜味，并被确认为各种风格的葡萄酒中普遍存在的的关键气味活性化合物。

挥发性酚类物质不仅可以在橡木桶陈酿过程中从橡木中提取，还可以从葡萄和酵母的代谢活动中获得。在这项研究中，通过GC-O分析，在未在橡木桶中陈酿的丹菲特葡萄酒中发现了五种挥发性酚类物质，包括愈创木酚、苯酚、丁香酚、4-乙基苯酚和丁香酚。其中，丁香酚的FD因子最大（FD≥729）。如表2所示，NFTM葡萄酒中4-乙基苯酚的FD系数最高（FD=243），而JP葡萄酒中愈创木酚的FD系数最低（FD=243）。同时，NFTM和EFHM葡萄酒中的苯酚和丁香酚的FD系数也高于JP葡萄酒中的。

酯类、高级醇类和脂肪酸主要来自于发酵过程。通过GC-O分析，共鉴定出13种酯类，与其他两种葡萄酒相比，NFTM葡萄酒中大部分酯类含量较高，如2-甲基丙酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯和乳酸乙酯。根据AEDA-GC-O/MS的结果（表2），3-甲基-1-丁醇（被鉴定为"化学、溶剂"味）和苯乙醇（被鉴定为"花香"味）在三个地区的葡萄酒中具有最大的FD因子（FD=2187），但EFHM葡萄酒中其余的高醇的FD因子低于其他两种葡萄酒中。在丹菲特葡萄酒中发现了五种C6醇，其中NFTM葡萄酒中的FD系数更高。三种葡萄酒中辛酸的FD因子大于243，这可能是丹菲特葡萄酒中潜在的关键香气化合物，有助于产生"奶酪"味。3-甲基丁酸也被认定为"奶酪"味，在JP葡萄酒中的FD系数最大（FD=729），而在NFTM葡萄酒中的FD系数只有27。

硫化物、内酯、呋喃、醛类和酮类也通过GC-O分析被确定。甲硫基丙醛和甲硫基丙醇在JP葡萄酒中的FD系数（FD=729）高于EFHM和NFTM葡萄酒中的系数。γ-壬内酯在三个地区的葡萄酒中的FD系数为81，被描述为具有椰子和甜味的香气。丁内酯在EFHM和NFTM葡萄酒中的FD因子较高，而反式威士忌内酯在JP葡萄酒中的FD因子较高。三个地区的葡萄酒中2-呋喃甲醇的FD因子比糠醛高81。2,3-丁二酮是最重要的酮类之一，主要为葡萄酒带来黄油和甜味的香气，在三个地区的葡萄酒中，其FD系数为729。

 

3. 三个地区丹菲特葡萄酒中主要挥发性化合物的差异

一些气味活性区不能被GC-O分析所识别，主要是由于峰的信号强度较弱。其中，考虑到对明显的花香和香料香气的感知，几个未知的化合物被推测为萜类和挥发性酚类（表2）。因此，除了通过GC-O鉴定的49个化合物外，还对丹菲特葡萄酒中的其他定性萜类化合物（(D)-柠檬烯、(E)-玫瑰醚、萜品醇、香茅醇和(Z)-橙花醇）和挥发性酚类化合物（2-甲基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-丙基愈创木酚、香兰素和异戊烯醇）进行量化并进行OAV分析以进一步研究（表3）。

 

 

三个地区的中国丹菲特葡萄酒中萜类化合物的总浓度在20.69μg/L到155.31μg/L之间。中国丹菲特葡萄酒中独特的花香可能归功于这些葡萄衍生的萜类化合物，特别是芳樟醇，在三个地区的葡萄酒中量化的八种萜类化合物中，芳樟醇的OAV最高。中国的这三个优质多伦特葡萄酒产区之间存在着明显的气候差异。天山北麓（NFTM）和贺兰山东麓（EFHM）都属于大陆性半干旱气候，与胶东半岛（JP）相比，日照时间更长，昼夜温差更大，光合有效辐射（PAR）更强，后者位于中国东部沿海，属于温带季风气候，降水更多。同时，与NFTM地区相比，EFHM地区的日照时间和PAR略短，但平均温度和降雨量更高。如表3所示，EFHM葡萄酒中总萜类化合物的浓度最高，其次是NFTM葡萄酒和JP葡萄酒。萜类化合物的积累可能受到阳光照射的影响，尤其是芳樟醇（EFHM葡萄酒中为98.04μg/L），EFHM地区较高的温度也可能增加萜类化合物的含量。因此，EFHM葡萄酒中萜类化合物的含量明显偏高，可能是由于综合环境条件所致，其中对葡萄中萜类化合物代谢的影响仍是一个值得关注的问题。

至于C13-降异戊二烯，β-大马士酮是最重要的化合物，在中国丹菲特葡萄酒中具有较高的OAV，范围从192.73到388.37，其中JP葡萄酒中的浓度最高（表3）。中国丹菲特葡萄酒中的总挥发酚浓度达到315.77 ~ 617.82 μg/L（表3），。因此，从葡萄果实中提取的高水平的挥发性酚类物质可以被认为是丹菲特葡萄酒的品种香气化合物。在挥发性酚类化合物中，愈创木酚、丁香酚和异丁香酚在至少一个地区的葡萄酒中具有高于1.0的OAV。此外，三种丹菲特葡萄酒中的挥发性酚类物质的浓度存在明显差异。

4. 香气重组

为了证明对中国丹菲特葡萄酒整体香气有贡献的挥发性化合物，我们进行了香气重组实验。重组模型由61个关键的气味活性化合物组成，包括49个通过GC-O分析确认的FD≥3的挥发性化合物，以及3.3节中讨论的其他5个萜烯类化合物和7个挥发性酚类化合物（表3）。如图1所示，重组模型的香气特征与原酒的香气特征相似，证实了61种关键的气味活性成分的贡献。三个地区的丹菲特葡萄酒的香气特征表现出明显的差异。在NFTM和EFHM葡萄酒中，黑色水果、紫罗兰、金合欢/丁香和蜂蜜的浓度较高，而JP葡萄酒中干草的浓度较高。结合CATA的结果（表1），可以总结出天山北麓和贺兰山东麓的丹菲特葡萄酒以花香和果香为主，而胶东半岛的葡萄酒则以明显的泥土/土壤、干草和药用物质的香气为特征。三个地区的丹菲特葡萄酒的不同表现可能是由于该品种独特的风土表现。

 

 

5. 通过省略测试识别气味活性化合物和它们的感官交互作用

在建立了香气重组后，我们准备了省略模型来探索丹菲特葡萄酒中八类挥发性化合物（A1-A8）的贡献（表4）。每种芳香化合物的加标浓度与贺兰山东麓的葡萄酒中测定的浓度一致，贺兰山东麓的葡萄酒被认为是能很好地表达丹菲特品种特征的典型葡萄酒。每个省略模型都通过三角测试与完全重组模型进行了比较。酯类、萜类、挥发性酚类和C13-降异戊二烯的省略被18位专家中的12位成功感知，显示出对丹菲特葡萄酒的香气感知有明显的影响。

 

 

根据CATA实验的结果，典型的丹菲特葡萄酒的香气特征被认为是突出的花香和香料味，这可能与高浓度的萜类和挥发性酚类物质有关。结合GC-O和OAV的分析结果（表2-3），推测芳樟醇（FD=729，OAV>1.0）、香叶醇（FD=729，OAV=0.76）、丁香酚（FD=729，OAV>1.0）、异丁香酚（OAV>1.0）和愈创木酚（FD=729，OAV=0.92）对丹菲特葡萄酒的典型香气贡献很大。为了进一步证实这一假设，我们通过15个香气省略模型（B1-B15）进一步研究了单个萜类和挥发性酚类的贡献，以及它们在香气表达上的感知互作（表4）。结果显示，与完全重组模型相比，单一化合物（B1-B5）的省略不能导致可识别的感知。然而，在二元混合物省略组（B6-B15）中，除了省略香叶醇和丁香酚（B13），其他组合的省略对丹菲特葡萄酒的香气感知有明显影响。这表明，感官上的相互作用不仅存在于同一化学类别的化合物中，也存在于不同香气描述的化合物中，即可能存在萜类化合物和挥发性酚类化合物对中国丹菲特葡萄酒香气感知的更复杂的贡献。

在省略和重建的模型中使用了描述性分析，以进一步探索。如表5所示，缺失芳樟醇和香叶醇（RW-T）的空白果香（P<0.05）、紫罗兰（P<0.001）和金合欢/紫丁香（P<0.01）的强度明显低于完全重构模型（RW），其中那些花香的感知与GC-O分析中这两种萜类化合物的识别相对应（表2），表明它们对多恩费尔德葡萄酒中紫罗兰和金合欢/紫丁香香气的直接贡献。没有愈创木酚、丁香酚和异丁香酚（RW-V）的紫罗兰的强度也比RW低（P<0.05）。虽然RW-V和RW的香料差异不大，但同时不含萜类和挥发性酚类（RW-T-V）的香料强度明显低于RW（P < 0.05）。此外，与RW相比，RW-T-V的黑果、紫罗兰和金合欢/丁香的香气强度明显降低，其中RW-T和RW-V的香气强度也较低，进一步证实了萜类化合物和挥发酚之间可能存在协同作用。

 

结论

利用分子感官科学的多种方法，对中国三个地区不同环境条件下的丹菲特葡萄酒的香气进行了全面的研究。总的来说，中国的丹菲特葡萄酒被描述为黑色水果、紫罗兰、洋槐/紫丁香、红色水果、香料、梅干、干草和蜂蜜。在地区差异方面，贺兰山东麓的葡萄酒萜类物质含量最高，被认为是典型的葡萄酒，具有突出的紫罗兰和金合欢/丁香的感觉，很好地表达了丹菲特的品种特征。天山北麓的葡萄酒具有与EFHM葡萄酒相似的香气特征，黑色/红色水果和李子干的味道更浓，主要是由于酯类物质的含量更高。与这两个具有大陆性半干旱气候的地区不同，胶东半岛具有温带季风气候的葡萄酒被认为具有蘑菇/泥土、干草和药用物质的香气，一些挥发性酚类和C13-降异戊二烯的浓度相对更高。基于AEDA-GC-O/MS和OAV分析，选择了61种关键的气味活性化合物，成功地重建了三个地区葡萄酒的香气特征，其中萜类化合物和挥发性酚类化合物可被视为丹菲特葡萄酒的品种特征化合物。遗漏测试和描述性分析的结果进一步表明，芳樟醇和香叶醇直接促成了花香，而愈创木酚、丁香酚和异丁香酚可以与萜类化合物产生协同作用，特别是在紫罗兰、金合欢/丁香、香料和黑色水果的香味上。