Plant Physiol. Biochem：转录因子VaNAC72调控中国野生葡萄VaCP17基因表达，提高耐寒性

转录因子VaNAC72调控中国野生葡萄VaCP17基因的表达，提高转基因葡萄的耐寒性

期刊：Plant physiology and biochemistry （6.5）

发表时间：2023.05

 

 

研究背景

植物需要自我调整以应对寒冷、干旱和盐碱等胁迫的发生。寒冷胁迫严重威胁植物的正常生长、发育和产量，并限制其地理分布。然而，植物已经进化出极其复杂的生理和生化机制，以确保它们在自然环境中的生存和选择。因此，阐明植物对寒冷反应的内在机制和挖掘冷胁迫调节级联将有助于抗寒性的分子育种。

冷胁迫可以诱导渗透应激和氧化应激，对植物内在生理和生化反应产生协同作用。在极端寒冷胁迫下，冰晶的形成会引起渗透应激，从而导致可溶性糖和脯氨酸的积累，尽管如此，这些代谢物参与植物的多种代谢反应，可以减轻对植物细胞的损害。另一方面，活性氧（ROS）在极端温度下的持续积累会诱发氧化应激，过量的ROS会导致脂质、核酸和蛋白质的变性，导致代谢紊乱。

植物半胱氨酸蛋白酶（CP）参与细胞内蛋白质降解和程序性细胞死亡（PCD），衰老和发育以及对病原体的抗性。此外，CP家族对氧化应激具有活性，在维持细胞代谢中起着至关重要的作用。PLCP是CP的一大类，它们的蛋白水解活性与植物免疫和生长密切相关。

在耐寒调节级联中，转录因子通过激活靶基因表达发挥核心作用，从而调节植物对冷胁迫的积极或消极反应。作为一个特殊的超家族，NAC转录因子在N末端包含一个保守的DNA结合域，在C末端包含一个可变的转录调控结构域。NAC转录因子广泛参与生物应激以及干旱等非生物胁迫、盐和寒冷等。山葡萄的VaNAC72（入藏号OP807460）也与ANAC072/RD26同源，但其功能，特别是在冷胁迫下仍然未知。

葡萄（Vitis vinifera L.）是全球广泛种植的水果作物。它具有优良的果实性状，但耐寒性差，因此冷胁迫对葡萄生产构成严重威胁。山葡萄是一种原产于中国东北的野生葡萄品种，具有很强的耐寒性，甚至可以忍受-40°C的低温。因此，探索这一耐寒种质资源的基因，通过分子育种进一步提高葡萄的耐寒性具有重要意义。

在我们之前的研究中，在冷胁迫下使用抗寒品种“双优”和对寒冷敏感的葡萄“红地球”进行的转录组测序分析确定了差异表达的转录因子基因VaCBF6。然后，鉴定出一种名为VaCP17的猎物蛋白，并在转基因拟南芥中初步证实了VaCP17在耐寒性中的积极作用；此外，已经鉴定出与VaCP17相互作用的VaNAC72，两者都可以在细胞核中形成蛋白质复合物。本研究通过VaCP1在冷敏葡萄“无核白”中的稳定过表达和VaCP17在“双优”叶中的瞬时沉默，研究了VaCP17的耐寒功能。随后，我们通过酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因检测（DLR）和VaNAC72在“双优”叶片中的瞬时过表达分析了VaNAC72与VaCP17的调控关系。此外，我们还通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补（LCA）等方法鉴定了与VaNAC72相互作用的蛋白，并通过DLR进一步分析了VaNAC72与相互作用蛋白之间的共调控关系，旨在揭示VaCP17介导的耐冷性的分子机制。

 

研究结果

1.VaCP17蛋白的特性

在我们之前的研究中，VaCP17-GFP在拟南芥原生质体中瞬时表达，这初步表明VaCP17位于细胞膜中。在这项研究中，VaCP17-GFP在烟草中瞬时表达，这进一步证明了携带GFP信号的VaCP17分布在细胞膜中，而空对照分布在整个细胞中（图1A）。此外，蛋白质检测显示GFP和VaCP17-GFP在烟草中均正常表达（图1B）。进一步分析了VaCP17的结构，发现它包含8个α螺旋，大量β-折叠和一些无规则卷曲（图1C）。VaCP17结构域分析表明其含有“peptiase - c1”，这是PLCP成员划分的基础，该结构域包含三个活性位点（图1D）。此外，VaCP17在N端附近含有一个跨膜（TM）信号肽（图1D），图S1显示了相同的结果。根据PLCP的隶属关系划分，我们将VaCP17与拟南芥中的PLCP聚类，聚类结果表明，VaCP17是典型的rd21类蛋白（图S2）。

 

 

2. VaCP17基因响应冷处理和外源激素

在−1℃处理下，“双优”中CP17的转录水平下降。“双优”（VaCP17）在3 h达到峰值，表达量是无核白VvCP17的4倍，差异具有显著性。3 h后，VaCP17继续降低。相比之下，VvCP17的表达水平几乎没有变化（图2A）。另一方面，VaCP17在外源性ABA处理后2 h的反应最强，是对照的3-4倍，然后表达逐渐下降（图2B）。同样，外源MeJA诱导VaCP17快速上调，在1 h达到峰值，是对照的8-10倍，然后保持在中等水平（图2C）。外源性SA处理后，VaCP17的表达迅速上调，并在10 h达到最高水平，是模拟的10倍以上（图2D）。这些结果清楚地表明，VaCP17可以通过冷处理，ABA，MeJA和SA诱导。

 

 

3.VaCP17基因的稳定过表达增强了转基因“无核白”的耐寒性

为了进一步分析VaCP17在葡萄中的生物学功能，通过稳定的遗传转化，VaCP17在“无核白”中过表达，获得了OE-VaCP17（24#、31#和35#） （图S3）。WT和OE-VaCP17在10°C环境下驯化1 d，然后在−1°C环境下处理。结果显示，经过60 h的冷处理后，OE-VaCP17系与WT相比具有相对的耐受性（部分萎蔫）（图3A）。

通过对WT和OE-VaCP17系冷处理前后60 h耐寒性相关生理生化指标的测定，发现WT和OE-VaCP17的REL、MDA含量和总叶绿素含量在冷处理前几乎没有差异。冷处理后，OE-VaCP17的REL水平和MDA含量显著低于WT，但OE-VaCP17的总叶绿素含量显著高于WT（图3B-D）。冷处理前，WT和OE-VaCP17的SOD、POD和CAT活性无显著差异，但OE-VaCP17系的这三种酶活性显著高于冷处理后的WT（图3E-G）。保护酶活性的增加可以有效地消除冷胁迫引起的ROS爆发。植物体内H2O2和O2 -的含量反映了ROS的代表性水平。

冷处理前，WT系与OE-VaCP17的H2O2和O2 -含量无显著差异，但这两项指标是冷处理后OE-VaCP17的1.2-1.5倍（图3H-I）。与此相一致的是，对H2O2和O2 -的组织化学分析进一步表明，冷处理前WT与OE-VaCP17株系的ROS积累几乎没有差异，而冷处理后WT叶片中积累了过量的H2O2和O2 -，而转基因株系叶片中H2O2和O2 -含量仅略高（图3J-K）。上述实验结果与WT和OE-VaCP17冷处理前后的表型一致。

接下来，利用RT-qPCR分析冷胁迫下WT和OE-VaCP17冷胁迫相关基因（VvKIN2、VvRD29B和VvNCED1）。结果表明，这些胁迫相关基因在WT和OE-VaCP17中均对冷处理有响应，且这些基因在OE-VaCP17中的表达比在WT中上调得更快，从而增强了转基因葡萄的耐寒性（图S4）。由此可见，OE-VaCP17的REL水平和MDA含量降低，叶绿素总含量升高，表明过表达VaCP17可以通过提高保护酶活性和胁迫相关基因的表达来提高抗寒性。

 

 

4.VaCP17基因的瞬时沉默降低了“双优”叶片的耐寒性

为了研究VaCP17在“双优”叶片中的耐寒功能，采用RNA干扰（RNAi）方法对VaCP17进行了特异性沉默。首先，BLAST预先选择特定片段，靶向沉默VaCP17（图S5A）。A组和B组（待转化前组）之间VaCP17的表达水平无差异，可用于后续的沉默实验（图S5B）。短暂沉默VaCP17后，将EV和KD-VaCP17的嫩绿叶片在10◦C环境下驯化12 h，再在-1◦C环境下处理36 h。RT-qPCR结果显示，冷处理前后，KD-VaCP17的相对表达量显著低于EV，说明短暂沉默对VaCP17的表达水平有一定程度的干扰（图S5C）。Western blot结果进一步显示，GFP在EV和KD-VaCP17材料中均能正常表达（图S5D）。此外，经过冷处理后，KD-VaCP17的叶片萎蔫程度高于EV，这初步表明，VaCP17的沉默降低了“双优”叶片对冷胁迫的耐受性（图4A）。

通过测量-1◦C冷处理36 h前后EV组和KD-VaCP17组叶片的生理生化指标，发现冷处理前REL、MDA和总叶绿素含量没有差异，但冷处理后，与EV相比，KDVaCP17组的REL水平、MDA积累和叶片褪绿急剧增加，这表明KD-VaCP17材料对冷处理后的冷胁迫比EV更敏感（图4B-D）。在冷处理前，EV组和KDVaCP17组之间的保护酶活性和ROS含量也没有差异。然而，KD-VaCP17经过冷处理后，与EV相比，不能有效提高保护酶的活性，因此伴随着更多的ROS富集（图4E-I）。这些结果进一步表明，VaCP17在葡萄对冷胁迫的响应中起着积极的作用。

 

 

5.转录因子VaNAC72的转录激活区分布在C端

为了进一步探讨VaCP17基因与VaCP17相互作用蛋白VaNAC72在转录调控水平上的关系，我们提前对VaNAC72进行了定性分析。结果表明，VaNAC72是NAC转录因子NAM亚家族的成员（图S6A）。此外，酵母表达结果显示，VaNAC72的转录激活区分布在C端（图2）。VaNAC72与VvNAC17的高度同源性密切相关（图S7）。

 

6.转录因子VaNAC72作用于VaCP17基因上游以介导其表达

VvNAC72可以识别CACGTG核心元件，我们在ProVaCP17上也发现了CACGTG核心元件（图5A），但VaNAC72与VaCP17之间是否存在调控关系尚不清楚。Y1H表明，在OD600 = 0.002的条件下，阴性对照在SD/-Leu + AbA200上不能正常生长，而实验组和阳性对照生长正常，说明VaNAC72可以结合ProVaCP17的NAC识别位点（NACRS）（图5B-D）。此外，DLR的结果初步证实，VaNAC72可以显著提高ProVaCP17的活性（图5E-F）。为了阐明VaNAC72是否介导了VaCP17的表达，我们在“双优”中瞬时过表达了VaNAC72。“双优”的叶子验证了这种调节关系。通过VaNAC72的背景检测、RT-qPCR以及瞬时过表达VaNAC72后的蛋白检测（图5G-I），我们发现“双优”叶片中过表达VaNAC72可以增加冷处理下VaCP17的表达（图5J）。结果表明转录因子VaNAC72作用于VaCP17的上游，促进其表达。

 

 

7.VaNAC72基因响应冷处理和外源激素

在-1◦C冷应激下，NAC72在“双优”（VaNAC72）中的表达水平持续升高，而在“无核白”（VvNAC72）中的表达水平在3 h后缓慢升高，但VaNAC72的表达水平约为VvNAC72的10倍（图S8A）。另一方面，ABA可以诱导VaNAC72的早期上调，随后略有下调，但在6 h时表达量达到最大值，是对照的8倍（图S8B）。MeJA也介导了VaNAC72的早期反应，在6 h达到最高，是对照的6倍（图S8C）。然而，SA诱导的VaNAC72在早期没有表达差异，但在6 h达到峰值，是对照的4倍（图S8D）。这些结果表明，VaNAC72对冷处理、外源ABA、MeJA和SA的响应存在差异，VaNAC72和VaCP17对ABA和MeJA都有响应，这可能与ABA响应元件（ABRE）和MeJA响应元件（MJRE）的存在有关（图S9）。

 

8.VaNAC72是一个在抗寒性中起积极作用的冷响应基因

通过VaNAC72在“双优”叶片中的过表达（图5G-I），进一步验证了其耐冷功能。将EV和OE-VaNAC72叶片提前在10℃下冷驯化12 h，然后在1℃下处理48 h。我们发现，经过冷处理后，EV的“双优”叶片的萎蔫程度高于OE-VaNAC72（图S10A）。初步表明，“双优”叶片瞬时过表达VaNAC72提高了叶片的耐寒性。通过测定在-1◦C处理48 h前后EV和OE-VaNAC72叶片的生理生化指标，发现冷处理前REL、MDA含量和叶绿素含量没有差异。然而，经过冷处理后，OEVaNAC72叶片的REL水平和MDA含量显著低于E，OE-VaNAC72叶片的叶绿素含量显著高于EV（图S 10B-D）。此外，保护酶活性和ROS测定结果表明，EV与OE-VaNAC72在冷处理前没有差异，但OE-VaNAC72叶片的保护酶活性比EV叶片冷处理后的保护酶活性增加更为显著（图 S10E-I）。

 

9.转录因子VaNAC72可以与转录因子VaCBF2形成同源二聚体或异二聚体

随后，我们通过cDNA文库筛选确定了VaNAC72的相互作用伙伴， VaCBF2在文库筛选中出现6次，是典型的C-repeat结合因子/DRE结合因子1s （CBF/DREB1s）转录因子（图S11A）。然后将VaCBF2作为猎物蛋白进行进一步验证。结果表明，PGBKT7 - VaNAC721 - 200aa /pGADT7组合和阴性对照在SD-TLHA和SD-TLHA/X-α-gal培养基上均不能正常生长。而含有pGBKT7-VaNAC721-200 aa/pGADT7-VaNAC72、pGBKT7-VaNAC721-200 aa/pGADT7-VaCBF2和2个阳性对照的4种组合在2种培养基上均能生长，且呈蓝色。初步认为VaNAC72可以与自身和VaCBF2相互作用（图6A-B）。此外，BiFC表明阴性对照烟叶中未检测到YFP信号，而两个实验组的细胞核中均检测到YFP信号（图6C-D），这是基于VaNAC72和VaCBF2在细胞核中的位置（图6E, S12）。LCA还证实了VaNAC72可以与自身和VaCBF2相互作用（图6F-G）。值得一提的是，RT-qPCR结果显示，葡萄CBF2对冷诱导有响应，且CBF2在“双优”中的表达水平明显较高（图S13A）。此外，根据VaNAC72和VaCBF2在“双优”根系中大量活跃的事实（图5K, S13B），我们推测VaNAC72和VaCBF2主要在“双优”根系中相互作用。这些结果表明，VaNAC72可以与VaCBF2形成同型二聚体或异型二聚体，两者都参与了冷胁迫。

 

 

10.转录因子VaNAC72与VaCP17蛋白或转录因子VaCBF2协同作用，强烈激活VaCP17基因的表达

DLR共表达结果显示，VaCBF2和VaCP17都不能改变ProVaCP17的活性，但VaCBF2或VaCP17的存在能更好地提高VaNAC72靶向ProVaCP17的调控能力（图7）。综上所示，VaCBF2和VaCP17都能协同VaNAC72有效调控VaCP17的表达（图8）。

 

 

 

结论

来自中国野生葡萄（Vitis amurensis） PLCP亚家族的RD21蛋白VaCP17编码基因VaCP17在葡萄中稳定过表达，证实了该基因的耐寒功能。“无核白”植株及其靶向瞬时沉默的研究“双优”叶子。由于胁迫相关基因（VvKIN2、VvRD29B和VvNCDE1）的快速上调，VaCP17的过表达增强了转基因“无核白”植株的耐寒性，这反映在电解质泄漏、MDA积累和ROS水平的降低上。转录因子VaNAC72在冷胁迫下VaCP17上游发挥正向调控作用，该调控通路依赖于ABA、MeJA和SA信号。此外，VaNAC72与VaCP17表现出一致的耐寒性。

此外，VaCP17可以与VaNAC72相互作用，形成VaNAC72对VaCP17的正反馈调控。此外，VaNAC72可以募集VaCBF2，协同促进VaCP17的表达。该研究为进一步揭示葡萄耐冷机理奠定了基础，为葡萄分子育种奠定了基础。