新疆农大：琐琐葡萄果实成熟过程中花青素、糖类和有机酸积累规律的研究

导读

本研究采用靶向代谢组学技术，准确定量分析了‘琐琐’葡萄浆果成熟过程中花青素、糖类和有机酸代谢物的代谢途径。我们分别检出花青素、糖类和有机酸代谢物33种、10种和36种。花青素含量最高的是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(136.343 ng/g)，在盛花后135 d达到最大值。糖类中果糖含量最高为167.69 ng/g（盛花后135天）。有机酸类中，酒石酸含量最高（37,196.67 mg/kg，盛花后105天），齐墩果酸含量较高（230.064 mg/kg，盛花后135天）。这些结果阐明了‘琐琐’葡萄成熟过程中花青素、糖和有机酸代谢物的积累和变化，为‘琐琐’葡萄的开发利用提供参考。

亮点：

1.以新疆传统药食同源植物‘琐琐’葡萄为试验材料。

2. 采用靶向代谢组学技术测定‘琐琐’葡萄中花青素、糖类和有机酸的代谢情况。

3.‘琐琐’葡萄中花青素以矢车菊素- 3 - O -葡萄糖苷为主，糖类以果糖为主，有机酸以酒石酸为主。

4. 在‘琐琐’葡萄中发现了齐墩果酸。

论文ID

原名：Study on the accumulation pattern of anthocyanins, sugars and organic acids in medicinal Vitis vinifera ‘SuoSuo’ during ripening译名：药用葡萄‘琐琐’果实成熟过程中花青素、糖类和有机酸的积累规律研究

期刊：Food Chemistry

IF：8.8   

发表时间：2023.08

通讯作者：周龙

通讯作者单位：新疆农业大学

实验设计

 

 

实验结果

 

1. ‘琐琐’葡萄浆果三个成熟阶段生长变化比较

‘琐琐’葡萄成熟过程中不同阶段浆果发育表型如图1所示。S1：盛花后95天，浆果呈绿色并开始软化。S2：盛花后105天，浆果变色、膨大，含糖量达到中等当量。S3：盛花后135天，浆果成熟度达到采收要求。随着时间的推移，浆果的纵向直径、横向直径、单果重和可溶性固形物含量呈明显的上升趋势。S1 ~ S3阶段果实的纵向直径分别为 5.67 毫米、6.31 毫米和 6.60 毫米，S3 比 S1 增加了 0.93 毫米，S2 比 S1 增加了 0.64 毫米。三个时期浆果的横向直径分别为 6.56 毫米、7.10 毫米和7.68 毫米，S3 比 S1 增加了 1.12 毫米，S2 比 S1 大 0.54 毫米。S1~S3阶段的单果重为0.19 ~ 0.30 g，其中S3比S1重0.11 g, S2比S1重0.06 g。S1~S3阶段的可溶性固形物含量为22.96% ~ 31.96%，其中S3比S1高9.00%，S2比S1高3.88%。而随着果实的生长，果实的硬度逐渐降低。3个时期的果实硬度分别为0.65、0.58和0.54 kg/cm²。S1硬度比S3高0.11 kg/cm², S1硬度比S2高0.07 kg/cm²。由此可见，‘琐琐’葡萄在成熟期表型变化较大。

图1 ‘琐琐’葡萄成熟过程中形态指标的测定。(a)果实成熟的三个阶段，(b)果实纵向和横向直径在三个阶段的变化，(c)单果重量在三个阶段的变化，(d)可溶性固形物含量在三个阶段的变化，(e)果实硬度在三个阶段的变化。不同小写字母表示差异有统计学意义(P < 0.05)。

 

2. ‘琐琐’葡萄果实在三个成熟过程中的生理变化

不同生长期葡萄果实的内在品质存在显著差异(图2)。在6项主要品质指标中，随着浆果的成熟，总酚、单宁、可溶性糖和糖酸的比例总体上升，维生素C含量和可滴定酸含量逐渐下降。S1和S3的最大差异是糖酸比。S1、S2和S3的糖酸比分别为29.67、50.02、63.67，S3的糖酸比是S1的2.15倍。S1~S3阶段的可溶性糖含量分别为18.94g/kg、29.36g/kg和38.93g/kg，S3比S1高51.33%。可滴定酸含量差异最小；S1~S3阶段含量分别为0.64%、0.61%和0.59%，S1~S3阶段含量仅下降0.05%。随着浆果成熟度的增加，浆果酸度下降，糖分大量积累。S3中总酚、单宁和维生素C的含量与S2和S1存在差异，且含量高于S2和S1。S1~S3阶段的总酚含量分别为5.29g/kg、5.52g/kg和7.57g/kg，S3的含量比S1高30.04%。三个时期的单宁含量分别为4.36g/kg、4.62g/kg和6.18g/kg，其中S3的含量比S1高29.54%。S1、S2和S3的维生素C含量存在差异，分别为6.74g/kg、5.87g/kg和4.07g/kg，其中S3最低， S1的含量比S3高39.57%。结果表明，随着‘琐琐’葡萄的成熟，酚类和糖类的不断合成和积累，酸性物质不断消耗。

图2 ‘琐琐’葡萄不同生长期生理指标差异分析。(a)可溶性糖；(b)糖酸比；(c)可滴定酸；(d)总酚；(e)单宁；(f)维生素C。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

 

3. 基于相关分析的‘琐琐’葡萄果实成熟过程中外观与生理指标的形态学变化

浆果的生长发育由感官和大小决定，并受内在品质的影响。为了阐明果实的成熟过程，我们将葡萄的表型与生理变化联系起来。如图3所示，浆果纵向直径与可溶性糖、糖酸比呈显著正相关，浆果横向直径与单果重呈极显著正相关。单果重与总酚含量呈显著正相关。可溶性糖和糖酸比与可溶性固形物和单宁呈正相关，浆果硬度与维生素C含量和可滴定酸呈正相关。总酚与单宁呈显著正相关，与可溶性糖、糖酸比呈正相关。果实纵向直径与维生素C含量、可滴定酸、果实硬度呈负相关；单果重与可滴定酸度、浆果硬度、维生素C含量呈负相关；浆果硬度与糖酸比呈负相关;总酚与维生素C、可滴定酸呈负相关。因此，在‘琐琐’葡萄的生长过程中，果实大小和单果重与总酚、可溶性糖和可滴定酸密切相关。

 

 

图3 葡萄浆果品质的相关分析。*在0.05水平上显著相关(双边)。VD：纵径；TD：横径；FW：果重；FH：果实硬度；SSC：可溶性固形物含量；TP：总酚；TC：单宁；SS：可溶性糖；TA：可滴定酸；SS/TA：可溶性糖/可滴定酸。

 

4.‘琐琐’葡萄果实成熟过程中花青素含量差异分析

为了比较‘琐琐’葡萄成熟过程中与花青素积累相关的代谢物的组成，我们采用LC-MS/MS法测定了‘琐琐’葡萄的花青素含量。我们共检测到33种花青素(表S1)，其中S1、S2和S3中分别检测到21个、29个和33个。对所检测的花青素衍生物(图4a)的主成分分析表明，PC1占总变量的73.28%，PC2占总变量的11.58%，S1、S2和S3之间有明显的分离，存在差异。我们通过聚类热图来分析花青素代谢物(图4b)，花青素代谢物主要集中在S3阶段，少量花青素代谢物分布在S1阶段。此外，33种花青素代谢物可分为8类(图4c)，其中最大的类是芍药素类(n=7)，分别在S1、S2和S3中检测到1、2和7种。

我们结合倍数变化值（FC≥2且FC≤0.5）和P值（P值<1）来筛选差异代谢物（图4d）。在S1 vs S2中有20种差异代谢物，其中上调代谢物19种，下调代谢物1种；S1 vs S3中有28种差异代谢物，其中上调代谢物26种，下调代谢物2种；S2 vs S3中有24种差异代谢物，其中上调代谢物23种，下调代谢物1种。S1、S2和S3中共有上调的差异代谢物：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷，锦葵花素-3-O-葡萄糖苷，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷，锦葵花素-3-O-(6-O-p-香豆酰)葡萄糖苷，芍药素-3-O-(6-O-p-香豆酰)葡萄糖苷；共有下调的差异代谢物：矢车菊素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)和柚皮素。我们利用KEGG数据库富集不同成熟度浆果中差异代谢物的代谢途径(图S1d-f)。S1 vs S2、S1 vs S3、S2 vs S3的差异代谢物在花青素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成和类黄酮生物合成的代谢途径中共富集。花青素代谢产物的检测结果与总酚的测定趋势基本一致。研究表明，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是‘琐琐’葡萄紫色果皮的主要物质。

 

图4 不同阶段花青素代谢物。(a)不同阶段花青素代谢物含量的聚类热图，(b)不同阶段花青素分类图，(c)不同阶段花青素的差异代谢物。(d)比较不同阶段差异代谢物。

 

5. ‘琐琐’葡萄果实成熟过程中糖分含量差异分析

我们在不同生长阶段的浆果中检测到10种糖类成分(图5)，不同成熟阶段的糖类物质含量存在显著或极显著差异。研究结果发现，‘琐琐’葡萄中乳糖、D-山梨醇糖、海藻糖、蔗糖、L-果糖和D -阿拉伯糖的含量随着浆果的成熟而增加。肌醇、鼠李糖、岩藻糖和阿拉伯糖从S1-S3减少。浆果中的主要成分为果糖、葡萄糖和蔗糖，其中以果糖含量最高。S1、S2和S3的果糖含量分别为144,977ng/g、158,920ng/g和167,696ng/g；葡萄糖含量分别为129.493ng/g、140.290ng/g和152.211ng/g；蔗糖含量相对较少，三个时期的含量分别为32.731 ng/g、34.745 ng/g和42.061 ng/g。浆果中其他糖类中D-阿拉伯糖的含量最低，并随着浆果的成熟而逐渐降低，S1、S2和S3的含量分别仅为0.040ng/g、0.037ng/g和0.025ng/g；其次是岩藻糖，S1 为 0.043 ng/g，S2 为 0.034 ng/g，S3 为0.030 ng/g。

 

图5 ‘琐琐’葡萄不同发育阶段糖分含量的差异分析。不同浆果成熟阶段糖代谢衍生物含量的变化，"*"表示差异显著（P < 0.05），"**"表示差异极显著（P < 0.01），"ns "表示差异不显著。

我们利用 KEGG 数据库富集了不同成熟度浆果的差异代谢物所涉及的代谢途径（图 S2）。S1 vs S3、S2 vs S3和S2 vs S3的差异代谢物在ABC转运蛋白、果糖和甘露糖代谢以及半乳糖代谢途径中共同富集。葡萄果实的糖代谢测定结果与可溶性糖测定结果基本一致。这些结果表明，果实的糖代谢和积累受到发育过程的严格调控，山梨糖醇在果实的运输和积累中起着重要的作用。

 

6. ‘琐琐’葡萄果实成熟过程中有机酸含量差异分析

为了比较‘琐琐’葡萄成熟过程中与有机酸积累有关的代谢物的组成，我们采用LC 3000高效液相色谱仪测定了有机酸的含量。在本研究中，我们共检测到36种有机酸(表S2)。在有机酸代谢结果的基础上，我们进行了主成分分析。第一主成分(PC1)对样本的贡献率为55.12%，第二主成分(PC2)对样本的贡献率为18.85%。各样品分布集中，表明组内样品重复性好，有机酸代谢物高度一致。不同成熟阶段的样本明显分开，表明成熟过程中有机酸代谢产物之间存在显著差异(图6a)。此外，对有机酸代谢物进行聚类分析（图6b）表明，约1/2的有机酸代谢物，如水杨酸、泛酸和没食子酸，随着浆果的成熟逐渐减少，它们在S1时期含量最高。大约1/4的有机酸代谢物，如酒石酸、富马酸和苯甲酸，在S2时期含量最高。1/4以上的有机酸代谢物，如莽草酸、苹果酸、齐墩果酸等，随着浆果成熟而逐渐增加，在S3期含量最高。‘琐琐’葡萄浆果中酒石酸含量最高，S2阶段最高含量为37,196.67 mg/kg，比S3阶段高出13.76%。富马酸含量第二，S2 中富马酸含量为 43,203.33 mg/kg，比 S3高 53.41%。含量最低的是邻氨基苯甲酸，在S3中为0.535 mg/kg。S1、S2、S3中齐墩果酸的含量分别为194.33 mg/kg、224.424 mg/kg、230.064 mg/kg。

我们结合倍数变化（FC＞2且FC＜0.5）和P值（P值<1），筛选出24种差异代谢物（图6c）。其中，S1 vs S2、S1 vs S3中各有6种上调、2种下调的差异代谢物；S2 vs  S3 中有3 种上调和 5 种下调的差异代谢物。通过差异倍数处理将三组结果转化为log₂^FC，筛选出差异倍数最大的代谢物和下调代谢物(图S3a-c)。在S1 vs S2中，上调最大的代谢物是乳酸，下调最小的代谢物是莽草酸。在S1 vs S3中，上调最大的代谢物是肉桂酸，下调最小的代谢物是邻氨基苯甲酸。S2 vs S3 中上调最大的代谢物是肉桂酸，下调最小的代谢物是乙酰丙酸。琥珀酸是 S1 vs S2 中上调的差异代谢物，也是 S2 vs S3 中下调的差异代谢物，说明‘琐琐’葡萄在S3成熟时，有机酸发生分解，琥珀酸发挥了重要作用。我们利用KEGG数据库富集了不同成熟浆果差异代谢物所涉及的代谢途径（图S3d）。S1 vs S2、S1 vs S3、S2 vs S3的差异代谢物在代谢途径、次生代谢物生物合成、三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、丁酸代谢、氨基酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物合成等代谢途径中共富集。有机酸代谢测定结果与可滴定酸测定结果基本一致。这表明，当‘琐琐’葡萄有机酸减少时，有机酸作为糖酵解、三羧酸循环和糖异生的底物被消耗。

图6 (a) PCA 图，(b) 聚类热图，(c) 上调和下调的有机酸差异代谢物的数量。

 

讨论

植物中的天然活性物质是研究热点和生物制药开发的关键来源。‘琐琐’葡萄作为药食同源的原料，具有丰富的药理活性。‘琐琐’葡萄浆果在成熟过程中花青素、糖类和有机酸的种类、含量和比例发生很大变化，这对葡萄浆果具有药用价值的形成也起着决定性的作用。

花青素是影响葡萄浆果颜色品质的最重要性状之一，在浆果成熟过程中会发生显著变化。本研究在‘琐琐’葡萄中鉴定出 33 种不同的花青素代谢物，其中 S1、S2 和 S3 中分别检测到 21、29 和 33 种。Colombo等人在研究葡萄的酚类物质时发现，成熟期花青素的含量和种类均高于其他阶段，这与本研究结果一致。我们在S3中检测到的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量最高，它是‘琐琐’葡萄果皮中的主要紫红色物质，同时，它在花青素代谢中起着非常重要的作用。Kyraleou等人通过分析希腊90多种红葡萄果皮中的花青素成分，发现锦葵花素 -3-O-葡萄糖苷是大多数葡萄果皮中花青素的主要成分。同时，在Mavrotragano果皮提取物中，芍药素和飞燕草素含量最丰富。对赤霞珠葡萄的研究表明，果皮中的花青素受控于F3'H和F3'5'H基因同时表达，其表达比例控制着葡萄皮中花青素的组成，若F3'H高表达，果皮中积累的矢车菊素较多，若F3'5'H高表达，果皮中积累的飞燕草素较多。结果表明，葡萄中花青素的主要成分因品种不同或基因调控不同而存在差异。此外，天然产物矢车菊黄素-3-O-葡萄糖苷具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖、保护心脏、预防糖尿病和促进血液循环的作用。例如Yang等人发现矢车菊黄素-3-O-葡萄糖苷通过抑制CD38的表达，干扰心肌细胞的凋亡和增殖以及糖酵解酶的变化，从而起到减轻心肌细胞衰老损伤的作用。这表明，在‘琐琐’葡萄作为药材时，矢车菊黄素-3-O-葡萄糖苷起着重要的作用。

糖的含量和组成对葡萄果实的风味、色泽和其他营养成分有重要影响。糖是葡萄果实中重要的营养物质和酒精发酵底物，是葡萄成熟的重要标志之一。葡萄果实中葡萄糖和果糖的含量几乎相等，是主要的糖类成分。在本研究中，果糖和葡萄糖是‘琐琐’葡萄成熟过程中的主要成分。三个生长周期的差异代谢物均为山梨糖醇，所涉及的代谢途径主要为ABC转运蛋白。研究发现，ABC转运蛋白参与代谢物和生长激素的转运、植物器官形成和细胞发育。结果表明，山梨糖醇在‘锁锁’葡萄果实的糖积累和果实生长中起着重要作用。以往的研究发现，从‘琐琐’葡萄中提取的蔗糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖组成的多糖具有很强的抗病毒、免疫增强和神经保护作用。Ma等人研究了‘琐琐’葡萄多糖对阿尔茨海默病模型大鼠的影响，发现‘琐琐’葡萄多糖可以减轻海马CAI区神经元的损伤和凋亡，提高阿尔茨海默病大鼠学习和保护海马神经元的能力。

葡萄果实中有机酸的组成和含量是决定果实风味和品质的重要指标。葡萄果实中的有机酸主要有酒石酸和苹果酸，还有少量的柠檬酸和琥珀酸。它们的含量和组成是形成葡萄浆果风味和品质的主要基础物质。研究者在新疆一种独特的葡萄中检测出36种有机酸，主要为酒石酸、富马酸和L-焦谷氨酸。此外，我们检测到更多的齐墩果酸，这是‘琐琐’葡萄药用价值的主要成分。Chahine和Tong等人鉴定了葡萄中41种有机酸，发现气候较冷的葡萄中可滴定酸的浓度较高，气候较暖的葡萄中乳酸的浓度较高。不同葡萄品种之间乳酸、丙酮酸和乙酸含量存在差异。齐墩果酸具有良好的药理活性，具有抗菌、抗癌、抗氧化和保肝作用。Liu等人研究发现，‘琐琐’葡萄果实中的齐墩果酸能够抵抗免疫损伤引起的小鼠肝脾肿大，并能有效恢复肝组织中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性。

 

结论

本研究利用靶向代谢组学技术，对浆果成熟三个关键时期的花青素、糖和有机酸代谢物进行了准确定量分析。我们共鉴定出花青素代谢衍生物33种，其中芍药素种类最多(n = 7)，矢车菊素-3-葡糖苷在S3中含量最高(136.343 ng/g)。在糖类成分中，我们共检测到10种代谢衍生物，其中果糖和葡萄糖含量最高，在S3时分别为167.69 ng/g和152.21 ng/g。我们检测到36种有机酸代谢衍生物，其中酒石酸为主要有机酸，在S2时含量最高，为37196.67 mg/kg。我们在果实中也发现了大量齐墩果酸，其随着果实成熟逐渐增加，在S3时含量为230.064 mg/kg。花青素、糖和有机酸的差异代谢物KEGG富集分析表明，花青素差异代谢物主要集中在花青素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成和类黄酮生物合成途径。糖的差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白、果糖和甘露糖代谢途径以及半乳糖代谢途径。有机酸的差异代谢产物主要集中在TCA循环、乙醛酸和二羧酸代谢、丁酸代谢、氨基酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物合成。本研究初步探讨了‘琐琐’葡萄果实成熟过程中花青素、糖和有机酸的积累趋势，为准确提取‘琐琐’葡萄有效成分奠定了理论基础。

 

原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37659294/