Food Chem：葡萄根系铜中毒引起的养分间的协同与拮抗：单作与间作

葡萄根系铜中毒引起的养分间的协同与拮抗：单作与间作

期刊：Food Chemistry（8.8）

发表时间：2019.01

 

研究摘要

 

长期使用含铜杀菌剂对葡萄园土壤造成污染，可诱发多种植物的铜毒性和营养失衡。本研究旨在评价铜对Fercal和196.17两种葡萄砧木的毒害效果，并探讨间作燕麦是否能缓解葡萄的铜毒害。采用水培方法对植物进行不同Cu浓度的处理。在收获时，测定生物量积累、SPAD指数以及共生和外质体根和叶离子体，以评估对其他微量和常量营养素可能的协同和/或拮抗作用。根分泌物分析与基因表达（VvPEZ-like）相关，而对葡萄和燕麦离体进行的主成分分析表明，在高Cu浓度下，单个和间作196.17砧木对根组织中的Zn和Mn均有正向影响，间作Fercal中Zn和Mn含量均增加，而单作Fercal中Zn含量则呈拮抗关系。结果表明，葡萄和燕麦在养分吸收上存在竞争，这一现象可能会缓解葡萄对铜的毒性。Fercal能充分利用燕麦，而196.17在间作制度下处于不利地位。间作制度可以有效抵消葡萄铜毒害但存在品种依赖性。

 

研究背景

 

使用含铜杀菌剂是栽培中最广泛使用的方法之一，以对抗霜霉病等真菌疾病。然而，这导致了许多农业土壤中铜的积累。铜的毒性特征已在多种植物中得到了研究。一般来说，Cu主要在根中积累，然而，芽和根都表现出特定的中毒症状。为了抵消或防止这些影响，植物进化出了不同的机制，根和微生物释放的低分子量有机化合物发挥了基础性作用。尽管铜毒性诱导的渗出模式是植物特有的，但葡萄尚未被描述。

据报道，高铜胁迫使根生长减少，该参数与葡萄品种有关，而梢发育的减少并没有品种特异性。从农学的角度来看，尤其需要通过特定的措施来控制和减轻土壤中Cu的毒性，从而获得植物有效Cu组分，如植物稳定法、植物萃取法等。事实上，铜的毒性已经证明会降低大量营养元素（Ca、Mg、K和P）的含量，在这方面，有机化合物的根释放，具有明显的金属络合能力。值得注意的是，当这种现象发生在两种间作植物（一种耐金属，一种不耐金属）的根际时，两种植物都能从中受益。

 

研究内容

 

1.植物物质和生长条件

三个月大的grape Fercal和196.17株根茎葡萄（Vitis vinifera x Vitis berlanderi）均来自当地苗圃，水培。栽培第12天，一半葡萄与燕麦间作，其余单作。采用5种不同Cu浓度（μM）: 0 （Cu缺乏率），0.2，5，25，50。

 

2.根分泌物收集与分析

 

3.植物生物量与SPAD指数

在收获时（移栽到水培系统后4周），利用便携式叶绿素仪SPAD-502）测定完全展开叶片的透光率，并以SPAD（单光子雪崩二极管）指数表示。

 

4.植物组织的矿物组成

 

5.生物信息学分析

 

6.实时RT PCR

 

7.统计分析

 

研究结果

 

1. SPAD指数

仅在间作中SPAD指数随Cu浓度的增加而显著变化（表1）。SPAD指数最高的是50 μM Cu处理的间作Fercal植株（与对照相比+13%），以及5和25 μM Cu处理的间作196.17植株（分别与对照相比+14%和+13%）。两种砧木间作时，燕麦的SPAD指数均以5 μM Cu和25 μM Cu处理最高。

 

表1 不同Cu浓度（0、0.2、5、25、50 μM）处理下单作、间作的SPAD指数、根冠生物量（DW）和茎根比

 

2.组织生物量和根冠比

50 μM Cu处理的单作Fercal和间作196.17植株的地上部生物量最低，间作Fercal和单作196.17砧木植株的地上部生物量无显著差异。此外，间作下燕麦植株的茎部生物量在50 μM Cu浓度下均有所减少（表1）。

随着Cu浓度的增加，只有单作Fercal砧和间作196.17根砧的葡萄植株的根冠比显著下降（表1）。Fercal间作的冠根比有更高的趋势。

 

3.营养物质

单作和间作的砧木植物都报告了宏量和微量营养素组织含量的变化，这取决于水培溶液中的Cu浓度（表2）。

 

表2 单作间作的Fercal和196.17砧木根外质体和共质体中常量和微量元素含量的测定

 

单作和间作均降低了Fercal根共塑锰、钙和镁的含量（表2）。在根外质体中，单作和间作的Fercal砧木在25和50 μM Cu条件下均表现出较高的Cu浓度和较低的Mn、P、Mg和S含量。在25和50 μM Cu条件下，单作和间作的Fercal根外质体中Zn含量下降，表现出不同的行为（表2）。以砧木196.17为例，最高Cu浓度（25和50 μM）导致单作和间作植株共质体Zn和P浓度升高，而Mn仅在间作的196.17根系共质体中降低。Fercal的叶离体除Mn在5 μM Cu下比对照降低外，没有表现出其他实质性变化（表4），196.17也类似。

 

表3 用Fercal和196.17处理燕麦根系外质体和共质体中常量和微量元素含量的测定

 

表4 单作和间作Fercal和196.17的砧木植物以及用Fercal或196.17种植的燕麦叶片的宏量和微量元素组成

 

4.多变量分析（PCA）

单作下，沿着第一个组分表征聚类的主要元素是根部共塑Cu和Mg以及外塑Cu和Mn（图1B）。

 

图1 单作Fercal和196.17砧木植物叶片和根系（外质体和共质体）离子组的主成分分析

 

间作下获得的PCA模型占总方差的93.2% （PC1为82.3%，PC2为10.9%）（图2A）。表征分离的主要元素是外质体Cu、Mn和P（图2B）。

 

图2 间作Fercal和间作196.17株砧木植物叶片和根系（同质体和外质体）离子组的主成分分析

 

主成分分析在不同Cu浓度下单株和间作Fercal植物上进行，描述了总方差的97.4%，其中第一和第二分量分别为84.5%和12.9%（图3A）。同样的分析用于196.17，描述了总方差的97.5%，其中第一分量为91.4%，第二分量为6.1%（图4A）。Fercal聚类的主要元素是外质体Mn、P、S和Cu以及共质体Cu（图3B），196.17砧木植株的聚类特征为第一个成分为外质锰，第二个成分为共质和外质铜（图4B）。

图8显示了 RR 组和 nR 组葡萄根中植物激素的内源含量。在 125 DAP时，RR 处理明显增加了 ABA 的含量，在 70 DAP时明显抑制了根中 IAA 的积累，但 RR 处理对 MeJA、GA、ZR 和 BR 的含量没有明显影响。

 

图3 单作和间作Fercal叶、根离子组的主成分分析

 

图4 单作和间作196.17叶片和根系（同质体和外质体）离子的主成分分析

 

在主成分分析中，以Fercal或196.17根砧木栽培的燕麦植株为样本，共发现3个聚类，占总方差的93.2%（第一成分为85.6%，第二成分为7.6%）。驱动这种分离的主要元素是共塑铁和铜，以及第一个组分上叶片和质外体中测定的铜，而第二个组分上的质外体锰（图5A和B）。

 

图5 与Fercal或196.17砧木间作的燕麦叶片和根系离子组的主成分分析

 

5.根分泌

根系分泌物模式分析揭示了酚类化合物、黄酮和黄酮醇的存在。在两种生长条件下，两种根茎植物的分泌物中均检测到酚类化合物，而黄酮和黄酮醇仅在间作时检测到（图6、图7）。

 

图6 单作、间作Fercal和196.17株砧木植物根系分泌物中总酚类化合物（TPC）随时间的变化

 

图7 单作、间作Fercal和196.17砧木植物根系分泌物中黄酮和黄酮醇含量随时间的变化

 

总酚类化合物的释放随砧木植株和/或生长条件的不同而不同（图6）。施用0.2 μM和5 μM Cu的单作Fercal植株在整个试验期间均呈现恒定的酚类化合物释放（图6A）。在处理后第4天和第7天（DAT），当植物分别在50和0-25 μM Cu下培养时，可以观察到两个渗出峰（图6A）。间作Fercal植株没有检测到这些峰（图6B）。间作Fercal植株在试验期间表现出恒定的酚类化合物释放，不同Cu处理之间没有差异。

单作196.17砧木植株在整个试验期间不断释放酚类化合物，Cu处理之间无差异（图6C）；然而，酚类化合物的浓度高于Fercal砧木植物渗出液。在间作的196.17株砧木植株上，处理之间也没有差异（图6D）。

黄酮和黄酮醇仅在间作的Fercal植物的分泌物中检测到（图7A和B）。黄酮醇的渗出模式显示，除了50 μM Cu栽培的植物在14 DAT时峰移位（图7A）外，所有Cu处理的黄酮醇的渗出模式在11 DAT时达到峰值（图7B）。黄酮释放量与黄酮醇释放量在试验期间呈相反趋势，不同Cu处理间无差异（图7B）。196.17植株则趋势不同。类黄酮和黄酮醇单作196.17的分泌非常低。

 

6.酚类外排转运蛋白（即PEZ）基因的鉴定与表达

生物信息学分析在葡萄球菌中发现了三个可能的PEZ基因，分别是VIT_210s0116g01880、VIT_212s0059g02180和VIT_212s0059g02160，以下分别称为VvPEZ1-Like、VvPEZ2-Like和VvPEZ3-Like（图8）。PEZ是multi - drug and Toxin Extrusion（MATE）基因家族的成员，该基因家族在植物中具有不同的功能。尽管它们与OsPEZ1和OsPEZ2的同源性比例低于51%，但已经在V. vinifera中发现了四个MATE成员（VvMATE1, VvMATE2, VvAM1和VvAM3）。另一方面，新鉴定的V. vinifera MATE家族成员的身份与O. sativa转运体的身份具有更高的百分比。此外，鉴定的三个基因都具有12个跨膜结构域，这是MATE转运体的特性。进行了系统发育分析，发现新发现的VvPEZ-like基因与OsPEZ基因聚类。vpez类基因均在对照葡萄砧木植株的根尖中表达，但其相对转录量因砧木植株、生长条件和Cu浓度的不同而不同。

 

 

图8 了解相关PEZ基因的MATE亲缘植物系统发育树

 

与单作相比，间作Fercal中VvPEZ1-Like基因的表达在所有铜浓度下都有所增加（图9A）。196.17株砧木则呈现相反的趋势，但只在5 μM Cu下相对表达量显著降低（图9B）。在间作Fercal中，在0.2 μM Cu时，VvPEZ2-Like转录显著降低，在25 μM Cu时显著升高，而在5和50 μM Cu时则没有被修饰（图9C）。以196.17株砧木为例，0.2、5和50 μM Cu处理的间作株中，VvPEZ2-Like基因的表达量显著增加，而25 μM Cu处理的间作株中，VvPEZ2-Like基因的表达量显著低于单作株（图9D）。在两种种植制度下生长的196.17株砧木中，仅在0.2 μM Cu下检测到VvPEZ3-Like转录本，间作比单作和25 μM下的含量都低，但仅在间作的196.17株砧木中检测到（图9F）。

 

图9 在单作和间作条件下，测定了Fercal（A, C和E）和196.17（B, D和F）砧木根组织中VvPEZ-Like基因的表达谱。与0.2 μM Cu的表达量相比，基因表达量为相对转录量

 

研究意义

 

从19世纪晚期开始，铜作为杀菌剂被应用于葡萄园中，以防治霜霉病，从而导致铜在土壤中积累，特别是表层土壤。因此，年轻的葡萄植株以较浅的根系为特征，生长在污染最严重的土层中，常表现出铜中毒的症状。在高浓度铜（即25和50 μM Cu）下，单作196.17砧木比Fercal生长更好。196.17砧木根系Cu浓度较低，渗出率较高，从而阻碍了酚类化合物与Cu络合作用对金属的吸附。在间作系统中，Fercal受铜毒害的影响小于196.17。间作增加了类黄酮、黄酮醇和总酚类化合物的释放，减少了根中铜的积累。间作可能会引起植物物种间的竞争。间作策略已被证明是一种有价值的降低葡萄铜毒害的策略，但其减程度高度依赖于品种。因此，应针对不同的砧木进行应用评价。

需强调的是，本研究是在水培条件下进行的，与土壤环境存在差异。