Plant Physiol. Biochem：TCP7在RBH诱导的葡萄采后抗性中的关键作用

TCP7在RBH诱导的葡萄采后抗性中的关键作用

期刊：Plant Physiology and Biochemistry（6.2）

发表日期：2024年7月

葡萄（Vitis vinifera L.）是一种全球性的商业园艺作物，拥有许多品种，由于其独特的风味和植物营养素含量而被大量消费。在全球范围内，红球、赤霞珠、梅洛和巨峰在所有主要葡萄产区都有种植。这些旗舰品种服务于餐桌和葡萄酒市场，但经常遭受白粉病、霜霉病、灰霉病腐烂和树干病害等疾病。这种广泛的威胁凸显了提高全球葡萄抗病性的迫切需要。此外，缺乏足够的冷链基础设施和有效的采后疾病管理，使得包括巨峰葡萄在内的收获葡萄极易受到一系列导致浆果腐烂和腐烂的真菌感染。在这方面，灰霉是一种坏死营养真菌，是葡萄腐烂、质量下降和重大经济损失的主要来源。管理收获后和一般植物病害主要依赖于合成化学杀菌剂，因为它们具有高效、方便和负担得起的特点。然而，杀菌剂的广泛使用会导致化学残留问题，有利于杀菌剂耐药病原体的发展，并导致环境问题。这些问题引起了相当大的公共卫生问题，并推动了消费者对以更环保的方式生产的无农药作物的需求增加。因此，研究人员探索了抑制葡萄和其他水果收获后霉菌变质的替代物质，以满足消费者的需求并满足政府机构日益严格的法规。

最近的研究表明，各种生物（真菌、细菌、病毒、昆虫）和非生物（例如化学和物理物质）诱导剂可以引发植物的快速抗性和防御反应，这种现象称为诱导抗性。启动是一个多方面的过程，它使植物能够快速启动针对生物和非生物胁迫的防御机制，从而提高抗病性和抗逆性。在我们目前的研究中，施用β-氨基丁酸（BABA）有效地启动了收获葡萄的启动反应，并引发了对灰葡萄孢菌的全身获得性耐药（SAR），从而防止了灰霉病的建立。植物激素水杨酸（SA）增强SAR反应调节元件NPR1的活性，促进其从细胞质转移到细胞核形成NPR1/TGA复合物，最终刺激SA反应性发病机制相关（PR）蛋白的积累。因此，SA在调节植物防御启动中至关重要。一般来说，植物中的SA合成通过两种主要方式发生，即异胆碱酸合酶（ICS）和/或苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）途径。ICS或PAL通路的激活可以增加拟南芥中SA的水平，从而诱导SAR和非生物胁迫抗性。R-β-高丝氨酸（RBH）是BABA的结构类似物，也可以诱导植物的启动反应。数据表明，RBH防御启动激活了不同的模式来对抗坏死和生物营养威胁。然而，RBH如何启动收获的葡萄以启动针对采收后真菌病原体的快速防御反应尚未探索，目前尚不清楚。

TCP转录因子（TF）家族对于各种植物生长曲线至关重要，包括种子发芽、叶子发育和开花。TCP主要与激素信号传导、昼夜节律反应，尤其是植物防御有关。TCP基因家族分为两类：I类和II类。两类中的TCP转录因子都具有由60个氨基酸残基组成的非典型碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）基序，主要参与DNA结合，与蛋白质相互作用，并定位于细胞核。拟南芥中共鉴定出24种I类TCP蛋白，其中AtTCP8/9/11特异性激活AtICS基因，增强SA合成。随后的研究发现，AtTCP8/14/15与AtNPR1发生物理相互作用，并且AtTCP15可以与AtPR5启动子区域的GCGGGAC基序结合，增强其表达。数据表明，TCP蛋白可能对SA诱导的植物防御至关重要。然而，VvTCP7在RBH诱导的抗病性中的作用，通过激活收获葡萄中的SA合成，其分子机制仍不清楚。本研究的目的是检查TCP在葡萄浆果中RBH诱导的启动反应中的参与。我们还希望从信号转导的角度探索采后果实中的引发抗性网络，以确定用于抗性种质的进一步育种和开发非杀菌剂采后保鲜技术的潜在靶点。

研究结果

2.1 RBH增强葡萄浆果对灰霉病的抵抗力

在储存过程中，灰葡萄孢菌的感染会导致葡萄果实出现严重的灰霉病。在接种灰葡萄孢菌后的前5天内，接种葡萄果实上的病害症状迅速加重（图1）。然而，在接种前用RBH（10mmol/L）对葡萄果实进行预处理，显著降低了这两个参数（图1A和B）。值得注意的是，RBH还降低了未接种但自然感染的葡萄果实的病害严重程度。感染且接种过的果实的果皮显得皱缩，感染部位周围的果肉变成了棕色色，但这些症状在用RBH处理的葡萄果实中出现得较晚且有所减轻（图1C）。

2.2 RBH启动增加葡萄浆果中SA含量并上调相关基因

评估了RBH处理对葡萄浆果中SA水平的影响以及参与SA合成的关键酶基因的表达（图2）。与未处理的对照相比，单独RBH启动和病原体接种均增加了SA含量（图2A），并在储存的5天内上调了SA生物合成基因（VvPAL、VvCM、VvICS、VvBA2H和VvIPL）的表达。值得注意的是，在先用RBH处理、随后再用灰葡萄孢菌进行刺激的葡萄果实中，SA合成基因的表达水平达到了最高值，且SA的含量也达到了最高值（图2B-F）。

2.3 RBH诱导对葡萄浆果SA依赖性防御响应的影响

接种灰葡萄孢菌上调了SAR、VvNPR1和SA依赖性基因VvPR1/2/5的主要调节因子的转录，在受RBH和病原体感染刺激的葡萄浆果中观察到的表达水平最高（图3）。值得注意的是，相对于未处理的对照，单独的RBH预处理也上调了所注意到基因的表达。

2.4 VvTCP7的系统发育分析和亚细胞定位

系统发育分析结果表明，VvTCP7与拟南芥AtCHE的相似性最接近（图4A）。RT-qPCR结果显示，在RBH诱导的防御反应过程中，VvTCP7转录本不断积累（图4B）。在亚细胞图像中，阳性对照GFP信号出现在烟叶的细胞质和细胞核中，而VvTCP7-GFP信号主要出现在细胞核中（图4C）。这些结果表明，VvTCP7是一种核定位蛋白，在收获后葡萄中RBH诱导的真菌抗性中具有高度诱导作用。

2.5 VvTCP7通过GGNCCC基序靶向其启动子来激活VvICS

TCP转录因子主要通过与下游启动子区域的GGNCCC基序结合来调节靶基因转录（Kosugi和Ohashi，2002）。系统发育分析还表明，葡萄中的VvTCP7在调节SA合成方面可能与拟南芥AtCHE具有相似的功能（图4A）。因此，我们进行了进一步的研究，以确定VvTCP7是否可以直接与位于相关SA合成基因启动子中的GGNCCC基序结合。VvPAL、VvCM、VvICS、VvBA2H和VvIPL启动子中的顺式作用元件表明，这五个SA合成相关基因都含有至少一个GGNCCC基序（图S1）。

在这方面，酵母一杂交（Y1H）分析结果表明，与pGADT7-VvTCP7+Y1HGold（VvICS-AbAi）共转化的酵母可以在SD/-Leu培养基上生长（图5A）。然而，用空pGADT7+Y1HGold（VvICS-AbAi）转化或与PGADT7-VvTCP7+Y1HGold（VvPAL/VvCM/VvBA2H/VvIPL-AbAi）共转化的酵母在含AbA的培养基上没有生长。这些数据表明，VvTCP7仅与VvICS启动子中的GGNCCC基序结合，导致AbA报告基因AUR1-C的表达。EMSA结果还表明，GST-VvTCP7只能与VvICS探针结合，如带移所示（图5C）。值得注意的是，在反应体系中使用GGNCCC基序的突变探针并未对带宽的变化产生显著影响，这表明VvTCP7特异性地与VvICS启动子结合。与Y1H和EMSA分析的结果一致，在烟草叶片中进行的DLR测定表明，将pGreenII62-SK-VvTCP7与pGreenII0800-LUC-VvICS共转明显提高了相对LUC/REN比值，相较于空对照以及pGreenII62-SK-VvTCP7+pGreenII0800-LUC-VvPAL/VvCM/VvBA2H/VvIPL而言（图5B）。综上所述，我们的研究结果表明，VvTCP7直接靶向VvICS启动子区域的GGNCCC基序，并激活VvICS的转录表达。

2.6 过表达VvTCP7的转基因拟南芥增强对灰葡萄孢菌的抗性

对拟南芥转基因株系的分析显示，VvTCP7的表达水平显著，特别是在OE-3，OE-14和OE-16株系中（图6A）。因此，选择这些株系进行进一步研究。如图6B和C所示，我们发现VvTCP7的异源过表达可能对转基因的正常生长产生负面影响，主要表现为叶片卷曲。当我们同时注射灰葡萄孢菌在过表达VvTCP7的转基因拟南芥和野生型时，所有三个独立的过表达株系都显示出对灰葡萄孢菌的增强抗性，并且台盼蓝染色水平较低（图6D）。相比之下，相对于接种的WT叶片，所有VvTCP7OE株系的叶片的病斑和坏死面积明显减少。此外，在与野生型（WT）植株相比，在接种桉树后6d期间，这些转基因系中SA响应防御基因（AtNPR1、AtPR1、AtPR2和AtPR5）的相对表达也显著上调，在RBH预处理的植株中表达量更高（图6E）。这些结果表明，VvTCP7过表达可显著减轻转基因植株的病原菌侵染。

2.7 AtTCP7突变减轻RBH触发的真菌耐药性

为了验证TCP7在植物免疫系统中的生物学作用，研究人员利用簇状规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统，在拟南芥中构建了AtTCP7的功能缺失突变体。如图7A-C所示，attcp7cas9突变体表现出植株矮化现象，叶片变小，鲜重减少，这与AtTCP7的表达水平降低有关，尤其是在CRP-2、CRP-6和CRP-9中，与野生型Clo-0相比。在这种情况下，CRP-2、CRP-6和CRP-9中观察到更大的病斑和更严重的品蓝染色（图7D）。尽管CRP-2、CRP-6和CRP-9中SA依赖性基因的转录水平降低，但与ddH2O处理的突变体相比，RBH诱导的突变体（RBH-IR）中NPR1、PR1、PR2和PR5的转录本积累仍具有统计学意义（图7E）。因此，AtTCP7似乎对RBH诱导的抗性（RBH-IR）有积极的促进作用。

综上所述，RBH能有效上调采后葡萄浆果中VvTCP7和SA生物合成基因的表达。VvTCP7和SA生物合成基因的上调伴随着SAR对灰孢杆菌攻击的抗性激活。在这种情况下，VvTCP7与调节SA合成的VvICS基因启动子内的GGNCCC基序结合。RBH上调TCP基因的表达，促进SA的合成，从而激活葡萄浆果的SAR耐药性。因此，RBH是一种理想的诱导剂，凸显了其在收获后水果真菌保护方面的潜在用途。需要进一步的研究来确定RBH诱导的耐病性信号转导途径在抗病性中涉及的具体机制。​​​​​​​