INT J BIOL MACROMOL：bHLH77通过稳定MYB15促进毛葡萄STS48表达及二苯乙烯合成

转录因子bHLH77通过稳定MYB15来促进毛葡萄中二苯乙烯合酶基因家族成员STS48的表达和二苯乙烯生物合成

期刊：International Journal of Biological Macromolecules（8.5）

发表日期：2025年5月

葡萄树在世界范围内广泛种植，不仅营养丰富，而且在经济和饮食上也具有重要意义，使其成为人们日常生活中的主要食物。目前，全球种植最广泛的葡萄品种是欧洲葡萄（Vitis vinifera）。然而，其对疾病的抵抗力有限，并且高度易受病原体的影响。在生长过程中，它也容易受到非生物胁迫的影响，这可能导致果实产量和质量下降。因此，为了减轻病原体的侵袭，葡萄藤的种植往往依赖于化学制剂和农药的应用，这可能对人体健康产生负面影响，造成环境污染，并产生病原体抗性[7]。

植物已经进化出一种固有的免疫系统，该系统依靠内源性细胞机制来有效应对病原体和非生物胁迫在其整个生长过程中带来的持续挑战。苯丙烷途径在植物中产生大部分植物抗毒素，产生二苯乙烯，二苯乙烯是次级代谢物和葡萄免疫的重要标志物。迄今为止已鉴定的>400二苯乙烯化合物中，大多数是由白藜芦醇产生的。

此外，STILBENE SYNTHASE/RESVERATROL SYNTHASE（STS/RS）是白藜芦醇生产中必不可少的酶，葡萄具有丰富的STS基因成员家族。研究表明，STS基因对于促进白藜芦醇积累至关重要，从而增强植物对感染的抵抗力。研究发现，VvMYB14和VvMYB15是调节二苯乙烯生物合成所必需的，因为它们通过打开STS基因启动子产生更高水平的二苯乙烯积累。至关重要的是，许多转录因子可以与其他转录因子相互作用以影响二苯乙烯的产生。例如，通过与VqMYB14和VqMYB15相互作用，VqWRKY53有利地调节二苯乙烯的积累。这些转录因子的鉴定揭示了理解二苯乙烯合成的新途径。

碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子广泛分布于植物和动物中，是植物中第二大转录因子家族。随着植物经历其生命周期并对生物和非生物胁迫做出反应，bHLH转录因子具有多种功能。葡萄中的多种bHLH转录因子，也可以参与非生物胁迫和苯丙烷代谢途径的调节。bHLH转录因子还参与SA和JA信号通路，增强植物抗逆性。

我们之前的研究表明，中国野葡萄转录因子VqMYB15可以调节二苯乙烯的积累并参与植物免疫反应。此外，还发现了转录因子VqMYB15和VqNAC44之间的相互作用，影响了下游二苯乙烯的合成。在这项研究中，通过基Y2H筛选发现VqMYB15（VIT_05s0049g01020）与VqbHLH77（VIT_05s0029g00390）相互作用，并通过酵母双杂交、BiFC、pull down和split-luciferase测定验证了这种相互作用。此外，VqbHLH77被证明可以直接增强VqMYB15的蛋白质稳定性。使用VqbHLH77作为关键的调节因子，我们发现它主要存在于细胞核中，并表现出很强的转录活性。VqSTS48（VIT_16s0100g01200）和二苯乙烯的表达水平升高，VqbHLH77和VqMYB15的暂时过表达可增强葡萄叶片的抗白腐病能力，表明该调节因子调节了STS活性。VqbHLH77在拟南芥中异源过表达，通过上游反应性ROS激活SA/JA信号通路，增强对丁香假单胞菌的抗性。此外，表型评估和VqSTS48表达分析表明，与VqMYB15-VqSTS48相比，VqbHLH77 + VqMYB15-VqSTS48的转基因品系对Pst DC3000表现出更高的抗性，特别是当它们用flg22预处理时。至关重要的是，我们发现与单独过表达VqbHLH77的植物相比，VqMYB15-VqSTS48和VqbHLH77 + VqMYB15-VqSTS48转基因株系表现出优异的抗病性。这表明二苯乙烯的积累是植物抗病性的关键因素。根据这些研究，VqbHLH77与VqMYB15相互作用以控制VqSTS的表达，从而改善二苯乙烯的产生并提高植物的免疫力。

2.1 VqbHLH77的克隆和序列分析

因为在我们之前的研究中，我们发现二苯乙烯可以显著提高植物的抗性，而合成二苯乙烯的酶——二苯乙烯合酶（STSs）是关键。据报道，转录因子VqMYB15可正向调节VqSTS48的表达。在这篇手稿中，我们以VqMYB15为核心，通过Y2H筛选，希望找到其他可以与VqMYB15相互作用的蛋白质或转录因子，经过实验筛选发现VqbHLH77可以与VqMYB15相互作用。因此，这里我们首先对VqbHLH77的序列进行了相关性分析。葡萄品种“山阳5号”的叶片获得了VqbHLH77的全长cDNA序列，该序列编码一个含有569个氨基酸的蛋白质。该蛋白质具有亲水性，分子量约为61.25千道尔顿，理论等电点（pI）为6.50。为了阐明葡萄bHLH 基因家族与其它植物（如拟南芥）之间的分类学和进化联系，我们从葡萄基因组（Vitis vinifera. PN40024.v4.53）中鉴定出了136个bHLHs基因成员，并构建了包含来自拟南芥成员的系统发育树。根据系统发育研究，植物中的bHLH超家族通常包含14至32个子家族。根据拟南芥bHLH蛋白的分类，在葡萄中鉴定出的136个bHLH蛋白序列被分为20个子家族。其中，bHLH77被归入IVc子家族（图1A）。三维结构建模和多序列比对分析表明，VqbHLH77具有DNA结合的HLH结构域，其中碱性区域的氨基酸H5、E9和R13是DNA结合所必需的。此外，使用Geneious软件对VqbHLH77、VvbHLH77（葡萄品种，XP_002264969.2）、AtbHLH62（拟南芥，BAD44326.1）、OsbHLH77（水稻，XP_015621927.1）、SbbHLH79（高粱，XP_002458978.1）、NtbHLH62（烟草，XP_016438666.1）和SlbHLH62（番茄，XP_004248023.1）的氨基酸序列进行了比较。正如预期的那样，所有氨基酸序列都包含典型的HLH结构域，VqbHLH77和VvbHLH77之间的序列一致性为99.12%（图1B、C）。为了阐明葡萄中bHLH基因的进化起源和系统发育关系，我们绘制了其与拟南芥关系的比较同源性图谱（图1D）。在葡萄和拟南芥之间，存在98对与bHLH相关的同源基因，这表明这些基因在进化过程中发挥了重要作用。

2.2 VqbHLH77定位于细胞核，在酵母中具有转录激活作用

为了确定VqbHLH77的亚细胞位置，利用农杆菌介导的瞬时转化，构建了VqbHLH77与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，并在烟叶中瞬时表达。使用共聚焦成像发现VqbHLH77-GFP融合蛋白的荧光信号选择性地定位于细胞核，而对照蛋白（2300-GFP）在整个细胞中显示出普遍的荧光分布（图2A）。

为了验证转录因子VqbHLH77是否具有转录激活活性，将VqbHLH77的全长编码序列克隆到pGBKT7载体中，生成重组质粒pGBKT7-VqbHLH77。实验结果表明，在补充X-α-gal的SD/-His/−Trp选择性培养基上，BD-VqbHLH77和阳性对照均表现出强劲的生长并产生蓝色调（图2B）。这一观察结果推断VqbHLH77在酵母系统内具有转录活性。

2.3 VqbHLH77与VqMYB15互作

在AH109酵母感受态细胞中，加入了AD-VqbHLH77和BD-VqMYB15以及一个VqMYB15自转录活性，以确认通过Y2H分筛所发现的VqbHLH77与VqMYB15之间的关系。随后，使用SD/−Trp/−Leu固体培养基培养酵母细胞3至5天。然后仔细挑选单个菌落，并将其转移到SD/−Ade/-His/−Trp/−Leu固体选择性培养基上，该培养基中添加了Xα-gal和50mM3-AT。实验结果表明，除了阳性对照外，AD-VqbHLH77和BD-VqMYB15转化体以及VqMYB15自激活组均表现出正常生长，并在培养基上呈现蓝色色斑。相反，在存在50mM3-AT的情况下，VqMYB15自激活组完全受到抑制。这些观察结果共同证实了VqbHLH77与VqMYB15之间的相互作用（图3A）。

为了阐明VqbMYB15和VqbHLH77之间的相互作用位点，我们将它们的序列截断为两部分：酵母共表达VqbHLH77和VqMYB15的C端和N端部分（称为VqbHLH77N、VqbHLH77C、VqMYB15N和VqMYB15C）（图3B）。根据实验结果，在用50mM3-AT和X-α-gal增强的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu固体选择性培养基上，在阳性对照组和实验组BD-VqMYB15C/AD-VqbHLH77C中仅观察到强劲的菌落生长和明显的蓝色（图3C）。这一发现表明VqMYB15C和VqbHLH77C促进了相互作用。

此外，我们还进行了BiFC和GST下拉测定。在双分子BiFC实验中，当pSPYNE-VqMYB15和pSPYCE-VqbHLH77共表达时，在烟草细胞核中仅检测到荧光信号，这与阳性对照[45]的观察结果一致（图3D）。pull-down测定的结果进一步表明，GST与MYB15融合，而不是单独的GST，可以在体外拉出His-bHLH77（图3E）。此外，对本氏猪笼草叶片进行的分裂荧光素酶实验显示，在共转化nLUC-VqMYB15和cLUC-VqbHLH77的样品中荧光素酶活性显著，而对照组的荧光素酶活性很低（图3F）。总的来说，这些发现为VqMYB15和VqbHLH77之间的直接物理相互作用提供了令人信服的证据。

为了进一步研究VqbHLH77与VqMYB15之间的关系，我们采用VIGS技术对五角莨叶中的VqMYB15进行沉默。我们发现，过表达VqbHLH77后，VqMYB15的转录水平没有显著变化（图4A），抑制VqMYB15对VqbHLH77的表达水平没有影响（图4B）。此外，我们还检测了下游VqSTS48和二苯乙烯含量的表达（图4C，D）。沉默VqMYB15并未降低VqSTS48的表达和二苯乙烯积累，表明VqbHLH77对VqSTS48的激活并不完全依赖于VqMYB15。这些发现进一步表明，VqbHLH77可能通过蛋白质-蛋白质相互作用在VqMYB15的上游发挥作用，从而可能调节控制二乙烯积累的调节途径。

2.4 VqbHLH77不激活VqMYB15的启动子，通过与VqMYB15的蛋白质相互作用间接调控VqSTS48

VqSTS48的产生受VqbHLH77和VqMYB15之间的相互作用的调节。将VqMYB15和VqbHLH77的编码序列独立克隆到pGADT7载体中，以更好地理解这一点，分别产生AD-VqMYB15和AD-VqbHLH77构建体。为了便于Y1H测定，VqMYB15或VqbHLH77的启动子区域也被添加到pHIS2载体中。根据实验结果，VqbHLH77和VqMYB15启动子不结合或激活，反之亦然（图5A、B）。这些发现表明这些转录因子与其各自的启动子之间不存在调节相互作用。此外，我们探索了VqbHLH77调节VqSTS48启动子的潜力，但结果表明在这种情况下也没有结合或激活活性（图S1）。

先前的研究已经确定了MYB15与STS48启动子之间的相互作用。在目前的研究中，我们通过Dual-LUC测定进一步证实了VqMYB15确实可以激活VqSTS48启动子（图S2）。因此，我们推测VqbHLH77通过其与VqMYB15的相互作用间接影响了VqSTS48的表达。为了实现这一假设，我们在烟叶中同时过表达VqMYB15和VqbHLH77，发现与单独过表达VqMYB15相比，VqSTS48增强了荧光素酶活性，这证实了上述推测（图5C，D）。

我们瞬时沉默葡萄叶片中的VqbHLH77，并接种葡萄白腐病，发现VqbHLH77瞬时沉默后抗病性减弱，VqSTS48的表达水平与对照样品相比降低。相反，过表达VqbHLH77增强了抗病性，VqSTS48的表达水平升高。并且发现二苯乙烯的含量也遵循相同的趋势（图S3）。此外，如图6E和F所示，VqMYB15和VqbHLH77的共过表达显著增强了对白腐病的抗性，VqSTS48的转录水平超过了单独使用VqMYB15过表达时观察到的水平（图55G）。此外，根据对二苯乙烯含量的分析，与单独过表达VqMYB15相比，VqMYB15和VqbHLH77的共过表达产生了明显更高的二苯乙烯含量。这些发现进一步证实了我们的假设，即bHLH77通过与VqMYB15的相互作用间接增强VqSTS48的表达，从而促进二苯乙烯积累的增加。

2.5 VqbHLH77增强了VqMYB15的稳定性

鉴于VqbHLH77和VqMYB15之间的遗传和物理相互作用，加上VqbHLH77相对于VqMYB15的上游调控作用，我们研究了这两种蛋白质之间的功能相互作用。在葡萄叶片中，分别过表达VqbHLH77（OE-bHLH77）和沉默VvbHLH77（pTRV-bHLH77），并提取植物总蛋白。在ATP存在下，将这些蛋白与纯化的VqMYB15-GST蛋白一起孵育。无论MG132处理如何，pTRV-bHLH77蛋白的降解速度明显快于对照，而OE-bHLH77蛋白的降解速度明显慢（图6A，B）。值得注意的是，MG132是一种特异性的26S蛋白酶体抑制剂，有效抑制了MYB15-GST的降解。这些发现表明，通过阻止26S蛋白酶体降解VqMYB15，VqbHLH77对于保持其稳定性至关重要。

2.6 VqbHLH77可以响应激素

长期以来，人们已经认识到植物激素对于调节生长发育和改变为植物提供胁迫和抗病性的信号通路至关重要。分别用SA、MeJA和GA处理五角蚯蚓叶片，并测定VqbHLH77的转录水平。结果表明，VqbHLH77对SA诱导反应迅速，并被上调（图7A）。它还在6h内对MeJA的响应表现出持续的上调（图7B），而其对GA的响应相对延迟（图S4）。随后，用JA合成抑制剂苯尼酮处理葡萄愈伤组织，然后暴露于PTI诱导子flg22，然后分析bHLH77的表达水平。结果显示，bHLH77表达受到显著抑制，表明其参与了葡萄中PTI触发的基础免疫（图7C）。

此外，为了进一步研究VqbHLH77对激素JA和SA的反应是否与对病原体感染的抵抗有关，我们产生了VqbHLH77过表达的拟南芥株系L#1、L#3和L#4，并对其进行了PstDC3000的接种实验。

无论是野生型植物还是转基因植物，以及活性氧（ROS）的形成以及叶片细胞死亡的情况。在接种后的第6天，Col-0植株的叶片开始出现黄化现象，与非转基因植株相比，其枯萎程度明显更严重（图7E）。同时，还测量了叶片中的孢子数量，结果表明转基因系中的孢子数量明显低于野生型（图7D）。此外，通过台盼蓝染色和活性氧积累测定，发现转基因系中的细胞死亡和活性氧诱导显著增加（图7F和G）。这些观察结果共同表明，VqbHLH77增强了转基因植物对PstDC3000的抗性，而活性氧的增加可能在这一过程中起着关键作用。其次，在转基因和野生型植物中，我们仔细分析了在病原体感染期间与JA和SA信号通路相关的基因的表达模式。PR1、PR5和NPR1被选为SA信号通路的关键基因，而PDF1.2、LOX3、PR3和PR4则被选为JA响应基因。与野生型植物相比，在整个过程中，与SA和JA信号通路相关的基因的转录水平要高得多（图7H）。

总的来说，这些发现表明VqbHLH77显着增强了植物抗病性。此外，SA/JA信号通路在这一过程中发挥着关键的调控作用，而ROS的激增有助于在植物免疫的初始阶段激活SA和JA。

2.7 VqbHLH77通过间接上调VqSTS48的表达，显著提高了转基因植株的抗病性

研究表明，包括葡萄在内的有限数量的植物具有由于二苯乙烯合成而增加的植物抗病性，而大多数其他植物，包括拟南芥，不具备二苯乙烯合成基因。因此，考虑到VqMYB15和VqbHLH77之间的相互作用影响二苯乙烯化合物的合成（图5G），我们在myb15-1背景中产生了转基因拟南芥品系，其中含有VqMYB15+全长VqSTS48（包括由天然启动子调控的整个编码序列）和VqbHLH77+VqMYB15+全长VqSTS48为研究二苯乙烯合成是否能提高植物抗病性，我们选择了VqSTS48表达水平较高的T3代纯合转基因株系：VqMYB15-VqSTS48（L#2、L#3、L#5）和VqbHLH77-VqMYB15-VqSTS48（L#1、L#2、L#4）进行后续实验。为了跟踪疾病体征的发展，对植物进行一整天的flg22处理。随后接种PstDC3000。

实验组包括VqMYB15+全长VqSTS48和VqbHLH77+VqMYB15+全长VqSTS48，它们相对于对照组MYB15–1的抗病性显著增强，无论是否存在flg22均是如此。这些发现得到了实验结果的证实。当用flg22进行预处理时，植物的整体表现明显优于未进行flg22处理的情况。无论是否存在flg22，与VqMYB15+全长VqSTS48相比，VqbHLH77+VqMYB15+全长VqSTS48的病害症状通常更轻微（图8A）。除了观察表型外，我们还对拟南芥叶片中的孢子数量进行了量化，并测量了VqSTS48的表达水平。根据研究结果，接受flg22预处理的植物的孢子数量更少，且通常VqSTS48的表达水平高于未接受处理的植物（图8B和C）。无论是否进行flg22处理，拟南芥植物中的VqSTS48都呈现出从AtMYB15–1到VqMYB15+全长VqSTS48再到VqbHLH77+VqMYB15+全长VqSTS48的表达水平逐渐升高的趋势。更重要的是，我们发现转基因植物VqMYB15+全长VqSTS48以及VqbHLH77+VqMYB15+全长VqSTS48（无论是否存在flg22）在植物表型和叶片表面孢子数量等方面表现出更强的抗病能力，优于仅过表达VqbHLH77的植物，这阐明了二苯乙烯在协调植物抗病性方面所起的关键作用。因此，这部分实验表明了芪类化合物积累的重要性，以及VqbHLH77和VqMYB15之间的相互作用能够显著增加芪类化合物的含量，从而提高植物的免疫力。

基于上述研究结果，我们提出了一种模型，其中MYB15充当中间桥，bHLH77通过与MYB15的相互作用间接调控二苯乙烯的合成，如图9所示。特别是，VqbHLH77和VqMYB15结合产生附着在VqSTS48启动子上的复合物，通过调节VqSTS转录充当二苯乙烯产生的正调节因子。此外，诱导子（如flg22）诱导的早期防御有效抑制病原体入侵，从而提高植物对病害的抵抗力。

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