J AGR FOOD CHEM：探索霞多丽葡萄酒典型风味的分子机制：具有榛子香气特征的强效芳香化合物鉴定

许多葡萄品种能通过其酿造葡萄酒的感官特性轻松区分，但从化学角度阐明其风味成因的品种却为数不多。例如，长相思葡萄酒的猫味（catty-like）与西柚味特征，与多官能团硫醇类化合物相关；麝香葡萄和琼瑶浆葡萄的独特风味，与单萜类物质有关；而雷司令葡萄酒的煤油味，则是由1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘（TDN）所导致。这些化合物均为葡萄品种固有成分，其在葡萄酒中的含量会受果实成熟条件和种植产区的影响。

霞多丽是全球种植最广泛的白葡萄品种，其酿造的葡萄酒能被专业人士轻松识别。多位学者研究指出，该品种葡萄酒最常见的风味特征包括“热带/绿色水果香”“黄油/焦糖香”“蜂蜜香”“烟熏香”“木质香”和“柑橘香”。对其挥发性化合物的鉴定研究，主要发现了非品种特征标记物的贡献。研究人员也在其中鉴定出葡萄源性化合物，但其含量与其他葡萄品种酿造的葡萄酒相近，因此无法将其视为霞多丽葡萄酒芳香典型性的成因。

然而，顶级的霞多丽葡萄酒具有复杂的香气层次，业内专家将其描述为带有“榛子香”“燧石香”“燕麦香”和“烤面包香”等风味特征。这一风味维度的研究却鲜有涉及，需要注意的是，该风味特征需与干白葡萄酒过早陈酿时，因索洛酮存在而产生的坚果味、咖喱味等异香区分开来。一直以来，被全球多数霞多丽酿酒商奉为典范的法国勃艮第霞多丽葡萄酒，均采用橡木桶酒泥陈酿工艺，这一工艺能有效抑制索洛酮带来的不良感官影响。苹果酸-乳酸发酵是霞多丽葡萄酒酿造中常用的工艺，在勃艮第产区尤为普遍，该工艺能增强葡萄酒的榛子风味，更能凸显其品种典型性。

尽管榛子（新鲜与烘烤）风味是霞多丽葡萄酒品鉴中反复提及的描述词，但目前尚无针对该风味的专项研究，也未从化学角度对其成因作出合理解释。因此，本研究采用感官导向的研究方法，旨在鉴定霞多丽葡萄酒中标志性榛子风味的分子成因。在证实榛子风味特征的研究价值后，本研究运用气相色谱-嗅觉联用、多维气相色谱-质谱联用等多种分析技术，筛选出具有该风味特征的化合物，并对其感官特性进行了评估。

详见原文。

3.1霞多丽葡萄酒中榛子风味的验证及相关化合物的真空蒸馏分离

在探寻霞多丽葡萄酒中榛子风味的物质基础前，先验证了该风味描述词的合理性。研究选取4款经葡萄酒专家评定、具有典型芳香特征的勃艮第产区霞多丽葡萄酒（CHSA5、CHCM6、CHCM7、CHPV2，详见表1），由24名品评人员组成小组开展感官分析。感官分析完成后，研究共收集到35个风味描述词，并按提及频次由高到低排序（图1）。“榛子”“杏仁”“佛手柑”“茉莉”“忍冬”“马鞭草”也成为高频描述词（提及频次＞5，图1），其中“榛子”的提及频次达17次，位列第五。这一结果证实，榛子风味是所选典型霞多丽葡萄酒的重要特征。

随后，研究选取10款葡萄酒开展真空蒸馏实验，包括上述4款典型霞多丽葡萄酒、2款无榛子风味的低典型性霞多丽葡萄酒，以及4款非霞多丽葡萄酒。通过对不同真空度和蒸馏时长进行多次试验，确定了分步蒸馏的工艺参数，最终得到三个馏分（具体方法见材料与方法部分）。研究将所得馏分随机呈给5名葡萄酒专家，由其对比各馏分的嗅觉特征。

对4款典型霞多丽葡萄酒的蒸馏结果显示，F1馏分带有明显的榛子、木质与马鞭草香气，而该香气在非霞多丽葡萄酒及低典型性霞多丽葡萄酒的F1馏分中均未被感知；F2馏分则呈现浓郁的黄油香气，且典型霞多丽葡萄酒的F2馏分还带有轻微杏仁香，这一特征同样未在非霞多丽葡萄酒的F2馏分中出现；F3馏分仅表现出干白葡萄酒的通用香气特征，如干杏、奶油面包香，无法用于区分霞多丽葡萄酒与其他品种葡萄酒。该实验结果表明，典型霞多丽葡萄酒的F1馏分因带有特征性榛子香气，是最具品种辨识度的馏分；带有杏仁香的F2馏分也具有一定品种特异性。因此，研究选取这10款葡萄酒的F1和F2馏分进行液液萃取，后续用于气相色谱-嗅觉联用分析。

3.2蒸馏物气相色谱-嗅觉联用分析揭示榛子风味香气区域及多维气相色谱-嗅觉-质谱联用实现相关化合物鉴定

为探究榛子风味的分子成因，本研究采用归纳法开展气相色谱-嗅觉联用（GC-O）分析，对上述霞多丽葡萄酒蒸馏馏分的液液萃取物进行一维气相色谱-嗅觉联用分析。仅选取10款受试葡萄酒的F1、F2馏分开展检测。研究对各分析人员的香气图谱进行整合，得到包含所有共识性香气区域的完整图谱。

检测结果显示，相同分析时长内，霞多丽葡萄酒萃取物中检测到的香气区域数量为80~90个，而赛美蓉、维欧尼、长相思、雷司令等非霞多丽葡萄酒萃取物中的香气区域均不足70个。对比霞多丽与非霞多丽葡萄酒的香气图谱发现，霞多丽葡萄酒图谱中存在16个具有榛子风味特征的香气区域（表3）。研究为各香气区域进行编号，并依据范登杜尔-克拉茨方程计算其线性保留指数（LRI）。这16个香气区域中，15个在F1馏分中被检测到，6个在F2馏分中被检测到。

随后，本研究对上述经GC-O分析的有机萃取物开展针对性的中心切割多维气相色谱-嗅觉-质谱联用（MDGC-O-MS）分析，以鉴定与榛子风味香气区域对应的化合物。在F1馏分萃取物中，于具有最强烈烤榛子香的F香气区域保留时间点进行30~33分钟的色谱峰中心切割，并将洗脱物转移至第二根毛细管色谱柱。在第二根非极性BP1色谱柱的出口处，检测到相同的烤榛子香气；对该保留时间下的质谱数据进行分析发现，一个初步鉴定为4-氧代戊酸乙酯的主要色谱峰与目标峰存在部分重叠（图2A）。扣除4-氧代戊酸乙酯对应的特征离子后，剩余质谱图与质谱数据库中1-乙基-2-甲酰基吡咯（化合物1，图3）的图谱完全匹配。通过纯标准品的单独进样与混合进样验证，确认目标物与标准品的保留时间、香气特征及离子碎片均一致。1-乙基-2-甲酰基吡咯也被称作茶吡咯，常见于乌龙茶、焙火绿茶中，亦存在于荷花与咖啡中；该化合物此前曾在美乐葡萄酒中被初步鉴定，本次研究为其在干白葡萄酒中的首次明确鉴定。

与F香气区域保留时间相近的G香气区域具有甜榛子香特征，研究采用另一套色谱柱系统（一维BP20柱-二维HP5柱）对该区域进行中心切割与分离。二维色谱分离后，在HP5柱保留时间50.5分钟处检测到一个主峰，该色谱峰的出峰时间与榛子香气的感知时间完全同步，且质谱图纯度良好（图2B），其离子碎片与1-甲基-2-甲酰基吡咯（化合物2，图3）的标准质谱图匹配。将1-甲基-2-甲酰基吡咯纯标准品单独进样并与葡萄酒萃取物混合进样，进一步验证了鉴定结果。

基于这两种吡咯类化合物的嗅觉特征，本研究进一步直接探究霞多丽葡萄酒萃取物中是否存在同系列化合物。在电子电离源中，吡咯类化合物的特征为含不饱和五元杂环的阳离子，据此本研究在气相色谱-质谱联用的总离子流图中靶向检测该类特征离子。对总离子流图的靶向筛选发现2个目标峰。这两个色谱峰的质谱图分别与2-乙酰基-1H-吡咯（化合物3，图3）和1H-2-甲酰基吡咯（化合物4，图3）初步匹配；通过在极性与非极性色谱柱上进行纯标准品单独进样和混合进样验证，最终确认了两种化合物。2-乙酰基-1H-吡咯此前仅在米酒中被发现，本次研究为其在葡萄酿造葡萄酒中的首次鉴定；该化合物在黑巧克力中被认为是形成果仁糖香气的关键物质。1H-2-甲酰基吡咯近期也被研究人员通过全二维气相色谱技术在赛美蓉与霞多丽葡萄酒中初步鉴定。还检测到另外一个色谱峰，对应物质为1H-吡咯（化合物5，图3）；经纯标准品验证，该化合物与具有烤坚果香的E香气区域匹配，且此前已在美乐葡萄酒中被发现。

本次研究鉴定出的这五种吡咯类化合物，均与霞多丽葡萄酒中的榛子风味香气区域相关，其中四种（1-甲基-2-甲酰基吡咯、1H-吡咯、1H-2-甲酰基吡咯、2-乙酰基-1H-吡咯）也在榛子萃取物中被发现，部分还被认为是榛子烘烤过程中的特征标记物。但目前关于这类化合物对榛子本身香气的贡献，相关研究仍较为匮乏。此外，本研究尚未明确鉴定出与A、B、C、D、H、I、L、O、P香气区域对应的化合物，推测色谱信号强度低、目标物与其他组分共洗脱是导致鉴定困难的主要原因，后续需进一步提高样品的纯化与富集程度，以完善相关化合物的鉴定清单。鉴于榛子风味是典型霞多丽葡萄酒的核心特征，本研究进一步对14款霞多丽葡萄酒和14款非霞多丽葡萄酒中这五种吡咯类化合物的含量进行单独分析与对比。

3.3葡萄酒提取物中吡咯类化合物的定量分析及其感官贡献评估

本研究采用固相萃取法提取葡萄酒中的挥发性有机化合物。在萃取前向葡萄酒中添加各目标物纯标准品，以此确定每种化合物的定量校正斜率，并对固相萃取提取物进行气相色谱-质谱联用分析，在特定时间窗口靶向检测特征质荷比离子（表2）。

N-取代吡咯类化合物1-甲基-2-甲酰基吡咯（化合物2）在霞多丽葡萄酒中的平均含量为916±213纳克/升，是非霞多丽葡萄酒的8倍，经克鲁斯卡尔-沃利斯非参数检验，二者含量存在极显著差异（p<0.005）。其同系物1-乙基-2-甲酰基吡咯（化合物1） 在霞多丽葡萄酒中的平均含量为300±94纳克/升，约为非霞多丽葡萄酒的4倍，该差异同样具有极显著性（p<0.001）。2-乙酰基-1H-吡咯（化合物3） 是五种吡咯中含量最低的，霞多丽葡萄酒中其平均浓度为223±46纳克/升，显著高于非霞多丽葡萄酒且组间差异极显著（p<0.001）。

1H-2-甲酰基吡咯（化合物4）在受试霞多丽葡萄酒是非霞多丽葡萄酒的5倍以上（含量分布见图3）；此前有研究测得该化合物在某款霞多丽葡萄酒中的含量达16800纳克/升，本研究也证实其在霞多丽葡萄酒中含量显著更高（p<0.005）。1H-吡咯（化合物5）在霞多丽葡萄酒中和非霞多丽葡萄酒二者无显著差异（p>0.05）；该化合物在两类葡萄酒中的含量分布重叠度较高，无法作为区分霞多丽与其他品种葡萄酒的特征物质。

为评估这些化合物对葡萄酒香气的贡献，本研究分别在模拟葡萄酒基质和干白葡萄酒中测定了各吡咯类化合物的嗅觉检测阈值。被称作茶吡咯的1-乙基-2-甲酰基吡咯（化合物1）是干白葡萄酒和模拟基质中嗅觉感知性最强的化合物，阈值均约为1毫克/升（表4）；1-甲基-2-甲酰基吡咯在葡萄酒中的感知阈值约为20毫克/升；五种吡咯中含量最高的两种——1H-2-甲酰基吡咯（化合物4）和1H-吡咯（化合物5），在葡萄酒中的嗅觉阈值分别为8毫克/升和26毫克/升（表4）；而含量最低的2-乙酰基-1H-吡咯（化合物3）同时也是嗅觉活性最弱的化合物，其在葡萄酒中的感知阈值超过120毫克/升（表4）。

以化合物实际含量与嗅觉阈值的比值计算气味活度值（OAV），结果显示所有吡咯类化合物的气味活度值均低于10⁻³，这表明单一吡咯类化合物对霞多丽葡萄酒的香气无感官贡献。考虑到这些化合物均含有五元杂环母核，推测它们之间可能存在协同作用，但向干白葡萄酒中添加与实际含量相当的五种吡咯混合液后，葡萄酒的香气特征未发生任何改变。因此，尽管这类吡咯化合物在霞多丽葡萄酒中含量更高，且自身具有杏仁/榛子风味特征，但其对本研究中受试霞多丽葡萄酒的风味并无直接影响。

3.4酿酒工艺参数的相关性分析

尽管上述吡咯类化合物（1-4）的含量均低于各自的嗅觉阈值，对葡萄酒香气无直接贡献，但其含量差异却能有效区分霞多丽葡萄酒与其他品种葡萄酒。研究表明，N-烷基-2-酰基吡咯可由α-氨基酸与糠醛（橡木释放的一种挥发性醛类物质）发生反应生成，这一发现为探究吡咯类化合物的来源提供了重要线索。此外，一项关于酵母细胞壁吸附橡木挥发性物质的最新研究发现，经橡木醇提物浸提的酒泥会释放出1H-2-甲酰基吡咯。上述研究结果共同表明，部分吡咯类化合物可能来源于橡木。

鉴于霞多丽葡萄酒相较于其他白葡萄酒更常采用橡木桶陈酿，本研究进一步检测了夏栎橡木桶桶板的醇水萃取物中吡咯类化合物的存在情况。气相色谱-质谱联用分析结果显示，橡木萃取物中检测到了吡咯类化合物2、3、4，未检测到1-乙基-2-甲酰基吡咯（化合物1）。这一结果提示，葡萄酒中的吡咯类化合物2、3、4部分来源于橡木；而霞多丽葡萄酒更常采用橡木桶发酵和陈酿的工艺特点，也与这一推论相契合。

但本研究也发现了与之相悖的现象：部分受试霞多丽葡萄酒中未检测到橡木特征标记物（顺式、反式橡木内酯含量低于定量限1微克/升），却仍含有较高水平的吡咯类化合物。另一方面，部分采用橡木桶陈酿的非霞多丽葡萄酒，其中1-乙基-2-甲酰基吡咯、1-甲基-2-甲酰基吡咯和2-乙酰基-1H-吡咯的含量却远低于霞多丽葡萄酒。此外，本研究对法国未接触橡木的霞多丽葡萄汁进行检测，发现其中已含有1-甲基-2-甲酰基吡咯和1H-2-甲酰基吡咯。

综上，未接触橡木的霞多丽葡萄酒中仍检测到高含量吡咯类化合物、橡木桶陈酿的非霞多丽葡萄酒中吡咯类化合物含量偏低，以及霞多丽葡萄汁中原本就存在吡咯类化合物这三个事实表明，吡咯类化合物并非仅来源于橡木，葡萄汁本身及葡萄酒的酿造过程也会产生这类物质。吡咯类化合物的品种源性与陈酿条件对其含量的相对贡献，仍需后续开展进一步研究予以明确。