HORTIC RES-ENGLAND：VvMYB44-VvERF045复合体通过激活VvSPS4表达参与脱落酸诱导的葡萄果实糖分积累

VvMYB44-VvERF045复合体通过激活VvSPS4表达参与脱落酸诱导的葡萄果实糖分积累

期刊：Horticulture Research（8.5）

发表日期：2026年02月

 

 

引言

 

糖是光合作用的主要产物，是植物生长发育的能量来源和代谢底物，同时也是响应环境变化的关键信号分子。在果树中，糖是可溶性固形物的主要成分，对果实风味品质起着决定性作用。成熟期液泡中可溶性糖的积累显著影响果实甜度和商品价值。糖含量受一系列酶和转运蛋白的协同调控，这些调控在转录、转录后和翻译后水平上都受到精细控制。了解调控糖积累的机制对于改善肉质果实的风味品质至关重要。

蔗糖是光合产物的主要形式，在源器官（叶片）中合成，随后通过韧皮部长距离运输，最终卸载到果实、根和花等库器官中。糖从源到库的分配涉及多个亚细胞水平的跨膜步骤，需要多种关键酶和糖转运蛋白。在果树中，蔗糖代谢循环（糖代谢的关键过程）中的关键酶包括转化酶（INV）、蔗糖合酶（SS）、己糖激酶（HXK）、果糖激酶（FRK）、磷酸葡萄糖异构酶（GPI）、蔗糖磷酸合酶（SPS）、蔗糖磷酸磷酸酶（SPP）等。此外，主要的糖转运蛋白家族包括蔗糖载体/转运蛋白（SUT/SUC）、单糖转运蛋白（MST），包括糖转运蛋白STP、己糖转运蛋白HT、液泡单糖转运蛋白TMT、早期响应脱水6-like（ERDL）、液泡葡萄糖转运蛋白vGT、质体葡萄糖转运蛋白pGlcT、多元醇单糖转运蛋白PMT和肌醇转运蛋白INT）以及“糖最终将出口转运蛋白”（SWEET）。这些转运蛋白在果实中协同发挥作用。糖卸载的强度和速度在很大程度上取决于这些酶和转运蛋白的丰度和活性，最终决定果实的糖含量。

植物激素是果实成熟和品质的关键调控因子，通过调节基因表达和蛋白质丰度来影响各种品质性状。糖代谢和运输与不同的激素通路交叉，包括ABA、乙烯、生长素等。乙烯和ABA是主要调控因子，分别在跃变型和非跃变型果实的成熟和品质形成中起关键作用。例如，乙烯处理促进香蕉、苹果和猕猴桃成熟过程中的糖积累。因此，在果实成熟过程中糖和植物激素之间存在密切关联，这需要在特定背景下进行深入研究。

MYB转录因子以其高度保守的MYB结构域为特征，在多种物种中被广泛鉴定，并在许多生物活动和代谢过程中发挥重要作用，包括生长、胁迫响应、激素信号转导和次生代谢。MYB家族分为三个亚家族：R1-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB；值得注意的是，植物中的大多数MYB属于R2R3-MYB类别。几项研究强调了R2R3-MYB转录因子在促进或抑制果实作物糖积累中的功能。例如，CmMYB113通过转录激活CmACO1和CmSPS1介导乙烯依赖的蔗糖积累，最终提高跃变型甜瓜果实的甜度。MdMYB305-MdbHLH33复合体正向调控三个糖相关基因（MdCWI1、MdVGT3和MdTMT2）的表达，从而提高苹果果实的糖含量。PuMYB12结合到PuSUT4-like的启动子区域以增强其表达，从而促进梨果实的糖积累。相反，FaMYB44.2负向调控FaSPS3的表达，从而抑制草莓果实的蔗糖积累。此外，CmERF1-2抑制CmMYB44，从而解除对CmSPS1和CmACO1的抑制，协调甜瓜果实中糖和乙烯之间的相互作用。虽然这些发现增强了我们对MYB转录因子在糖积累中作用的理解，但关键的调控方面仍有待充分阐明。这凸显了系统研究的必要性，将在后续分析中呈现。

葡萄是全球广泛栽培的多年生果树之一，因其风味、营养价值和加工特性（如酿酒、果汁、葡萄干和鲜食）在全球市场中备受重视。作为典型的非跃变型果实，葡萄为研究激素与非跃变型果实成熟之间的关系提供了一个有吸引力的实验系统。在我们先前的研究中，我们报道了一个ABA介导的转录级联反应，涉及VvGRIP55、VvMYB15和VvSWEET15，与葡萄果实的糖运输相关。在本研究中，我们探讨了ABA对葡萄果实成熟和可溶性糖含量的影响。此外，我们利用激素处理后四个阶段的果实样本生成了转录组数据集，从而能够通过WGCNA构建与可溶性糖积累相关的潜在调控网络。我们的发现鉴定出VvMYB44，一个在ABA处理后成熟果实中表达量最高的候选转录因子，它通过直接结合到VvSPS4的启动子并激活其转录来增强蔗糖生物合成。此外，VvMYB44和VvERF045协同促进VvSPS4的表达。值得注意的是，过表达VvERF045促进了番茄果实的糖积累。总的来说，这项研究为葡萄果实糖积累的调控机制提供了新的见解。

 

结果

 

2.1 ABA处理对葡萄果实成熟和可溶性糖含量的影响

为了研究ABA对果实成熟和可溶性糖含量的影响，在转色前对‘玫瑰香’葡萄果实进行了500 mg L⁻¹ ABA处理。ABA处理加速了成熟进程，表现为更早的果皮着色和增强的果实膨大（图1A）。与对照相比，ABA处理下果实重量、赤道直径（ED）和纵径（LD）显著增加（补充数据图S1A-C）。值得注意的是，与对照相比，ABA的施用导致总可溶性固形物（TSS）积累更快、更高（补充数据图S1D）。此外，ABA处理后果实中葡萄糖和果糖的含量更高且积累更快。蔗糖含量在葡萄果实中保持较低水平，在处理后36天没有显著变化（图1B-D）。因此，ABA强烈促进了葡萄果实中可溶性糖的积累。为了揭示成熟过程中的全基因组转录响应，对ABA处理的‘玫瑰香’葡萄果实进行了RNA-seq。在接头修剪和质量过滤（Q30 ≥ 91.99%）后，将干净读数（每个样品5.92至10.24 Gb）比对到葡萄参考基因组，比对率为68.48%至92.76%（补充表S1）。总共21个样本中表达了26,087个基因，三个生物学重复之间的高度相关性（补充表S2）。

 

 

2.2 加权基因共表达网络的构建

为了深入了解ABA处理对葡萄果实代谢变化的调控效应，利用14个样本的转录组数据进行WGCNA。聚类树状图显示生物学重复间具有高相关性，分支表示具有相似表达模式的样本（图2A）。根据其类似的表达谱，共鉴定出10个共表达模块（图2B；补充表S3）。模块-性状相关性的热图显示，棕色、蓝色、品红色和青绿色模块中的转录本与关键性状（如蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖的积累）呈负相关，这些糖在成熟过程中显著增加（图2C）。这些结果表明，这四个模块中的基因主要与‘玫瑰香’葡萄果实的成熟过程和可溶性糖积累相关。

 

 

2.3 可溶性糖代谢调控网络的生成

为了进一步探索可溶性糖代谢的潜在转录调控机制，我们基于上述对照组和ABA处理葡萄果实的转录组数据集，从棕色、蓝色、品红色和青绿色模块中筛选了参与可溶性糖代谢和运输的SGs以及TFs，使用特征基因连接性阈值（|KME|≥0.8，补充表S4）。该过程共鉴定出19个SGs，包括INVs、SSs、SPSs、SUCSs、HTs和SWEETs，以及135个TFs，如MYBs、WRKYs、ERFs、ARFs、NACs、bZIPs和bHLHs（补充表S5）。随后，我们将选择范围缩小到12个表达水平与三种可溶性糖积累模式高度相关的SGs。我们还鉴定出128个与这12个SGs高度相关的TFs。然后将该基因集可视化为相关网络（图3A；补充表S6）。此外，我们提取了140个基因的转录水平。其中，5个SGs和44个TFs在ABA处理组和对照组之间表现出差异表达（图3B；补充表S7）。这些发现表明，该调控网络中鉴定的49个基因可能响应ABA信号，并在调控葡萄果实可溶性糖代谢中发挥关键作用。

 

 

2.4 VvMYB44调控葡萄愈伤组织和番茄中的可溶性糖积累

为了评估调控网络中基因的作用，我们重点关注VvMYB44基因，该基因在上述44个TFs中于ABA处理后的成熟果实中表达量最高（补充表S7）。我们成功从‘玫瑰香’葡萄中分离了VvMYB44的全长编码序列（CDS）。系统发育分析表明，VvMYB44属于R2R3-MYB家族，与拟南芥AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77具有同源性（图4A）。将VvMYB44-YFP融合蛋白与核标记物在烟草叶片中瞬时共表达。正如预期，观察到VvMYB44-YFP与NLS-mCherry完全共定位，证实VvMYB44定位于细胞核（图4B）。然后我们评估了VvMYB44在‘玫瑰香’葡萄果实发育阶段的表达模式。VvMYB44转录水平在花后60至110天（DPA）表现出高丰度（图4C）。为了研究VvMYB44在调控靶基因和影响糖积累中的功能作用，我们生成了三个过表达VvMYB44的葡萄愈伤组织株系（株系2、4和5）（图4D）。通过qRT-PCR分析验证了遗传转化的有效性（图4G）。值得注意的是，与野生型（WT）相比，三个过表达株系中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量显著更高（图4E）。调控网络分析显示VvMYB44与10个参与糖代谢的SGs（包括INVs、SSs、SPSs和SWEETs）高度相关（图4F）。我们检测了一些重要靶基因的表达，发现VvNINV3、VvSS2、VvSPS4和VvERD6L8在VvMYB44过表达愈伤组织中上调（图4G）。基于这些相关性，VvNINV3、VvSS2和VvSPS4被确定为VvMYB44的候选靶基因。此外，我们在番茄中生成了三条VvMYB44过表达株系（株系1、3和7）（图4H-J）。与我们在葡萄愈伤组织中的发现一致，过表达果实中的可溶性糖含量显著升高（图4K）。我们进一步分析了过表达番茄果实中候选靶基因同源物的表达水平，发现与WT相比，SILINT、SILIN8、SININV、SINVINV、SISSA、SISPS、SISPS4和SISPSB显著上调（补充数据图S2A）。此外，番茄中其他与糖积累相关的基因，如SISUT1、SISUT4、SITST1和SITST2，在VvMYB44过表达株系中也显著被诱导（补充数据图S2B）。总体而言，这些结果表明VvMYB44通过调节葡萄果实中VvNINV3、VvSS2和VvSPS4的表达，在可溶性糖积累中发挥关键作用。

 

 

2.5 VvMYB44结合到VvSPS4的启动子区域以增强其表达

为了研究VvMYB44是否通过转录激活介导可溶性糖积累，我们首先扫描了三个候选靶基因的启动子区域。该分析仅在VvSPS4的启动子中鉴定出一个AtMYB44的结合基序。我们进行了酵母单杂交（Y1H）实验以确认VvMYB44与VvSPS4启动子的结合。将VvSPS4启动子插入到PlaC2i载体中，同时将VvMYB44的CDS插入到pB42AD载体中。同时携带proVvSPS4-PlaC2i和VvMYB44-pB42AD构建体的EGY48酵母细胞在含X-gal的SD/Trp/-Ura培养基上变为蓝色。相反，携带proVvSPS4-PlaC2i和空pB42AD质粒的酵母细胞未显示蓝色（图5A）。此外，考虑到VvSPS4启动子中存在MBS基序，我们使用VvMYB44-His融合蛋白进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）。结果表明，VvMYB44-His能够直接结合MBS基序。重要的是，竞争性冷探针显著降低了与VvMYB44结合相关的信号，而突变探针则破坏了结合（图5B）。这些发现证实了体外VvMYB44与VvSPS4启动子之间的相互作用。随后，我们在烟草叶片中进行了双荧光素酶报告（DLR）实验。将VvMYB44克隆到效应载体中，将VvSPS4启动子克隆到pGREENII0800报告载体中（图5C）。同时共表达35S::VvMYB44和proVvSPS4-LUC的叶片表现出比表达空载体与proVvSPS4-LUC的叶片更强的发光强度（图5D）。总之，这些结果表明VvMYB44结合到VvSPS4的启动子区域，在体内和体外增强其表达。

 

 

2.6 VvMYB44和VvERF045协同激活VvSPS4的表达并增强可溶性糖积累

为了进一步研究VvMYB44如何调控可溶性糖积累，进行了酵母双杂交（Y2H）实验以评估VvMYB44与VvERF045之间的相互作用，VvERF045是乙烯、BR和ABA通路的关键整合因子[58]。如图6A所示，携带VvMYB44-pGBKT7和VvERF045-pGADT7的酵母细胞在含X-α-Gal的SD/Trp/-Leu/-Ade/-His培养基上生长旺盛并变为蓝色。然后我们使用GST-抗体包被的树脂进行pull-down实验。结果显示，VvMYB44-GST直接结合VvERF045-His，而单独的GST未显示结合（图6B）。为了证实体内的相互作用，在烟草叶片中进行了双分子荧光互补（BiFC）实验。共表达VvMYB44-nYFP和VvERF045-cYFaP对导致细胞核中功能性YFP的重建，而在对照组合中未观察到YFP信号（图6C）。此外，Co-IP实验表明，在存在VvMYB44-GFP的情况下，使用抗GFP抗体能够共免疫沉淀VvERF045-Myc，而在阴性对照中未检测到Flag信号（图6D）。这些发现共同证实了VvERF045在体外和体内与VvMYB44相互作用。为了评估这种相互作用是否影响VvSPS4的转录调控，使用上述报告子和效应子以及额外的35S::VvERF045效应子在烟草叶片中进行了DLR实验（图6E）。与单独使用VvMYB44相比，共表达VvMYB44和VvERF045进一步增强了VvSPS4启动子驱动的发光和LUC活性（图6F和G）。为了研究VvERF045是否影响可溶性糖积累，我们生成了三条过表达VvERF045的番茄株系（株系2、3和5），并通过转化验证成功（图6H-J）。值得注意的是，与WT相比，所有三个过表达株系的葡萄糖、果糖和蔗糖水平均显著更高（图6K）。总之，这些结果表明VvMYB44和VvERF045协同激活VvSPS4的表达并增强可溶性糖积累。

 

 

结论

 

在这项研究中强调了ABA对葡萄成熟和可溶性糖积累的积极影响。利用外源激素处理‘玫瑰香’葡萄果实的转录组数据集，我们构建了一个可溶性糖积累的潜在调控网络。通过该分析，我们鉴定出5个SGs和44个TFs，它们可能响应ABA信号以调节葡萄果实中的可溶性糖代谢。值得注意的是，我们鉴定了VvMYB44转录因子，它在葡萄果实的转色期和成熟期高表达。VvMYB44似乎通过结合到VvSPS4的启动子并激活其表达来影响蔗糖代谢。此外，发现VvERF045与VvMYB44相互作用，进一步增强其对VvSPS4的转录激活（图7）。这些发现为葡萄果实可溶性糖积累的分子机制提供了新的见解。