INT J BIOL MACROMOL：VaMAPK9调控山葡萄抗寒性的功能研究

VaMAPK9调控山葡萄抗寒性的功能研究

期刊：International Journal of Biological Macromolecules（8.7）

发表日期：2026年

 

 

引言

 

山葡萄是我国特有的野生葡萄，具备极强的耐低温能力，对极端低温环境适应性突出。已有研究表明，山葡萄枝条可耐40±5℃低温，根系能够耐受14±1℃的冻害，是挖掘抗寒基因、改良抗寒性状、选育抗寒葡萄新品种的核心种质资源。因此解析山葡萄抗寒分子机制，对葡萄抗寒育种意义重大。

植物应答低温胁迫是一套复杂多层级调控网络，涉及膜脂重塑、钙信号、转录调控、MAPK活性氧信号级联、激素调控等多个层面。低温胁迫会诱导活性氧大量积累，引发膜脂过氧化，损害植物生长、造成产量损失。为抵御低温伤害，植物借助跨膜信号级联完成低温感知与驯化。细胞膜流动性改变、蛋白构象变化、细胞骨架重排是植物应对低温的初级应答反应。与此同时，胞质钙离子浓度升高作为第二信使，激活钙依赖蛋白激酶（CDPK）与钙调蛋白（CaM），调控下游转录因子。

转录调控层面，ICE1CBF通路是植物响应低温的核心通路。ICE1结合CBF基因启动子，激活CBF表达，进一步诱导下游COR基因，提升植株抗冻能力。除此之外MAPK信号通路同样参与低温应答。拟南芥中MPK3、MPK6磷酸化ICE1，促使ICE1经蛋白酶体降解，解除其对抗寒的正向调控；而MKK1MKK2MPK4级联通路通过抑制MPK3/6活性，正向调控植物低温适应性。

MAPK级联是高度保守的三级激酶系统（MAPKKKMAPKKMAPK），通过苏氨酸酪氨酸双磷酸化传递信号，放大生物与非生物胁迫信号并传递给下游靶蛋白，在植物耐盐、抗旱、抗极端温度等逆境适应中起到关键作用。越来越多证据证明MAPK级联是植物低温胁迫应答的核心调控因子。低温条件下MAPK模块通过依次磷酸化转导信号，调控基因表达与生理驯化，增强抗寒性。拟南芥、水稻、玉米、马铃薯中的研究揭示了MAPK在低温适应中既有保守功能，也存在物种特异性。

本研究从山葡萄不同低温驯化阶段的转录组数据中筛选得到VaMAPK9，通过同源克隆获得该基因，完成山葡萄MAPK家族全面的生物信息学分析。qRTPCR证实VaMAPK9受低温正调控，4℃低温处理下表达呈动态变化。为解析其功能，分别在葡萄愈伤组织、葡萄叶片、拟南芥中进行过表达，同时在葡萄愈伤组织和叶片中开展RNAi沉默。对低温胁迫处理后的VaMAPK9过表达愈伤组织与野生型愈伤组织开展转录组测序，解析其参与低温应答的分子机理。本研究丰富了山葡萄抗寒分子机制认知，为葡萄抗寒育种提供理论依据、基因资源与技术支撑；同时系统解析山葡萄MAPK基因家族，阐明家族成员VaMAPK9的生物学功能。

 

结果

 

2.1MAPK基因家族鉴定与生物信息学分析

通过筛选鉴定，从山葡萄基因组中共鉴定得到11个MAPK家族成员。理化性质分析结果显示，这些蛋白的氨基酸长度介于375799个氨基酸，分子量40.8590.03kDa，等电点(pI)5.609.23（附表S3）。稳定性评估显示，蛋白不稳定指数42.1860.15，脂肪族指数74.8288.16，总平均疏水性(GRAVY)为0.621~0.314。亚细胞定位预测结果显示：4个家族成员定位于细胞质，7个富集在细胞核内（附表S3）。构建山葡萄、拟南芥、水稻MAPK蛋白的系统发育树（附图S1A），48个MAPK蛋白被划分为AD四个亚组。A亚组包含4个VaMAPK、8个AtMAPK、4个OsMAPK；B亚组包含4个AtMAPK、2个VaMAPK、2个OsMAPK；C亚组包含2个VaMAPK、5个OsMAPK、3个AtMAPK；D亚组包含3个VaMAPK、5个AtMAPK、5个OsMAPK。该进化树表明各物种MAPK功能结构域进化保守，推测依靠基因复制和功能分化维持不同物种信号通路的保守性。染色体定位分析表明，11个VaMAPK基因分布在8条染色体上（附图S2A）。VaMAPK1位于2号染色体；VaMAPK2位于5号染色体；VaMAPK3/4共同定位在6号染色体；VaMAPK5VaMAPK9分别位于12、15、17、18、19号染色体；VaMAPK10、VaMAPK11染色体位置尚未确定。另外，对基因启动子顺式作用元件分析，识别出四大类功能元件：光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件、生长发育相关元件（附图S2B）。

 

2.2低温胁迫下山葡萄MAPK家族基因表达分析

基于已获得的转录组测序数据，分析山葡萄‘左山1’在不同低温胁迫处理时长下8个差异表达MAPK基因的表达变化。如图1A所示，低温胁迫显著诱导8个MAPK基因发生差异表达，其中VaMAPK9（GSVIVG01014081001）的表达变化最为显著。VaMAPK9的组织特异性表达结果表明，非生物胁迫下该基因存在明显的器官表达差异（图1B），根中的表达水平显著高于茎和叶。对根组织进一步qRTPCR验证，转录组的表达趋势得到确认：随着处理温度不断降低，VaMAPK9的表达量持续上调（图1C）。农杆菌介导烟草表皮细胞瞬时转化，激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位。结果显示VaMAPK9编码蛋白主要定位于细胞质，同时存在微弱的细胞核定位信号（图1E）。

 

 

2.3VaMAPK9基因克隆

qRTPCR结果表明低温处理后‘左山1’中VaMAPK9显著上调，选取该基因开展功能验证。琼脂糖凝胶电泳得到大小约1842bp单一条带，连接pARTCAMEGFP载体测序，序列与预测CDS相似度99.8%，与预期片段长度一致。将重组质粒热激转化大肠杆菌感受态。

根据VaMAPK9编码区设计RNA干扰引物，PCR扩增得到约300bp片段，构建pUBGFPRNAi载体，电泳、测序验证载体构建正确。

 

2.4葡萄叶片瞬时表达VaMAPK9提高植株抗寒性

结果显示，低温处理条件下，VaMAPK9OE叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm显著高于空载对照EVOE（图2C）；而VaMAPK9RNAi叶片呈现相反的变化趋势。低温诱导后，VaMAPK9OE植株内VaMAPK9转录水平显著升高（图2E）；VaMAPK9RNAi株系基因表达被抑制。低温处理后，VaMAPK9OE和VaMAPK9RNAi株系相对电解质渗漏率均显著高于空载对照（图2D、图3D），说明VaMAPK9表达异常会破坏细胞的细胞膜完整性。以上瞬时表达实验证明VaMAPK9参与葡萄低温适应性调控。对瞬时转化葡萄叶片开展VaMAPK9介导的低温生理响应分析，系统比较VaMAPK9OE、VaMAPK9RNAi、空载对照组在低温胁迫下氧化胁迫指标、渗透调节物质的变化。常温条件下，不同基因型之间MDA、H₂O₂含量、抗氧化酶活性均无显著差异。低温胁迫后基因型之间出现明显差异：VaMAPK9OE株系H₂O₂与MDA积累量显著低于野生型（图2F、2G）；VaMAPK9RNAi株系氧化损伤加重，二者含量显著升高（图3F、3G）。抗氧化酶系统分析：低温胁迫后，VaMAPK9OE株系POD、SOD、CAT活性协同增强，高于野生型（图2HJ）；VaMAPK9RNAi株系酶活性显著受抑制（图3HJ）。POD通过两种途径提升抗逆：直接清除活性氧，同时调节CAT活性维持H₂O₂代谢稳态。渗透调节物质测定结果：低温下VaMAPK9OE株系脯氨酸积累量显著高于野生型（图2K），RNAi株系脯氨酸含量下降（图3K），证实VaMAPK9正向调控脯氨酸合成，增强细胞渗透调节能力。综上，VaMAPK9通过激活抗氧化酶系统提升ROS清除效率、促进脯氨酸合成、维持细胞膜稳定性，进而提升葡萄耐低温能力。MDA含量与脯氨酸积累呈显著负相关。

利用qRTPCR进一步解析VaMAPK9对葡萄叶片低温应答基因的调控。分析常温、低温胁迫条件下VvCBF1、VvCBF2、VvCBF3、VvICE1的表达模式。常温条件下，VaMAPK9OE和野生型相比，VvCBF1、VvCBF2无显著差异，VvCBF3、VvICE1表达存在差异（图2L）。低温处理后，空载植株上述基因表达被抑制；VaMAPK9OE株系基因显著上调。与之对比，低温胁迫后VaMAPK9RNAi株系VvCBF2、VvCBF3诱导能力减弱，VvICE1表达受到抑制（图3L）。结果表明：VaMAPK9通过正向调控CBFICE1信号模块增强抗寒性；过表达VaMAPK9能够协同激活低温诱导的VvCBFs和VvICE1表达。

 

 

2.5低温胁迫下转VaMAPK9葡萄愈伤组织抗寒性分析

将野生型、VaMAPK9OE、VaMAPK9RNAi转基因愈伤进行低温处理。常温条件下，转基因与野生型愈伤生长状态正常，无明显表型差异。4℃低温黑暗处理30d后，VaMAPK9OE愈伤生长速率下降，但褐化程度显著轻于野生型（图4A）。qRTPCR证实，常温与低温条件下VaMAPK9OE株系VaMAPK9表达量均显著上调（图4B）。相反，VaMAPK9RNAi株系低温胁迫后褐化加快（图5A），靶基因表达显著被抑制（图5B）。表型与分子结果共同证明：VaMAPK9表达水平与葡萄愈伤抗寒能力正相关，VaMAPK9作为正向调控因子提升山葡萄抗寒性。

系统分析野生型、VaMAPK9OE、VaMAPK9RNAi愈伤组织氧化胁迫与渗透调节应答。常温条件下，各组H₂O₂、MDA、POD/SOD/CAT酶活、脯氨酸含量无显著差异。低温胁迫之后：VaMAPK9OE株系膜脂过氧化产物H₂O₂、MDA积累量显著低于野生型（图4C、4D），同时抗氧化酶活性、脯氨酸含量同步上升（图4EH）。VaMAPK9RNAi株系H₂O₂、MDA含量显著高于野生型（图5C、5D），胁迫条件下抗氧化酶活性显著下降（图5EG），脯氨酸合成能力明显降低（图5H）。结果说明VaMAPK9OE可同时激活抗氧化防御系统、渗透调节通路，缓解低温造成的氧化损伤；基因干扰则会造成渗透稳态失衡。VaMAPK9依靠双重调控网络提升植物细胞低温适应能力。

qRTPCR检测转基因愈伤抗寒基因表达。低温胁迫之前，VaMAPK9OE株系和野生型相比，VvCBF1、VvCBF2、VvCBF3、VvICE1表达无显著差异。低温处理后，VaMAPK9OE株系这4个基因显著上调（图4I）；VaMAPK9RNAi株系相比野生型，这些抗寒相关基因表达下调（图5I），低温显著抑制大部分抗寒基因的表达。证明这些基因参与葡萄愈伤低温应答，其表达水平反映植物对低温环境的适应和耐受能力。

 

 

2.6VaMAPK9过表达转基因拟南芥抗寒性

T₀代转基因拟南芥种子在添加卡那霉素的1/2MS培养基筛选，挑选生长健壮T₃代株系OE1、OE2、OE3，以Col0野生型作为对照（附图S6AC）。

为进一步评价过表达VaMAPK9拟南芥抗寒能力，选取3个过表达株系开展低温抗性鉴定。T₃代植株置于5℃处理，记录胁迫前后表型。胁迫前Col0与转基因株系无肉眼可见差异；低温胁迫48h后，Col0植株损伤程度显著重于转基因株系（附图S7A）。存活率统计结果也印证该现象（附图S7B）。低温处理前，转基因株系和Col0的相对电导率、叶绿素含量没有显著差异；低温胁迫之后，转基因株系两项指标均显著优于Col0（附图S7C、D）。

开展生理生化分析解析Col0和VaMAPK9OE拟南芥低温应答机制，测定H₂O₂、MDA、脯氨酸含量，SOD、CAT、POD抗氧化酶活性。常温条件下Col0和转基因株系各项指标无明显差异。低温胁迫后，Col0叶片H₂O₂、MDA显著升高（附图S7F、G）。细胞膜稳定性是抗寒关键指标，结果证明过表达VaMAPK9显著缓解低温诱导的细胞膜损伤，维持细胞结构完整。CAT、POD、SOD核心抗氧化酶协同清除胞内ROS，减轻氧化伤害。低温条件下VaMAPK9OE植株CAT、POD、SOD活性显著高于Col0（附图S7HJ），说明VaMAPK9通过激活抗氧化酶网络，提升ROS清除能力，增强低温胁迫耐受性。脯氨酸作为关键渗透调节物质，胁迫前不同基因型之间没有差异；4℃低温处理24h后，转基因拟南芥脯氨酸积累量显著高于野生型（附图S7K）。以AtActin作为内参基因，2⁻^ΔΔCt法qRTPCR定量。4℃低温处理前，转基因株系与Col0相比，AtCBF1/2/3、AtICE1表达无显著差异。低温胁迫24h之后，转基因株系中AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、AtICE1表达量相比Col0显著上调（附图S7L）。

 

2.7转录组数据分析

对低温处理24h后的VaMAPK9OE与野生型愈伤开展RNAseq测序。葡萄愈伤低温胁迫不同比较组的差异表达基因(DEG)数量差异明显。WTvsVaMAPK9OE1：1005个基因上调，1033个基因下调，上下调数目接近。WTvsVaMAPK9OE3：1537上调，3120下调，下调基因远多于上调。WTvsVaMAPK9OE4：差异基因总数最少，335上调，692下调，同样下调占比更高（图6A、6B）。三组比较共存在493个共有差异基因。其中WTvsVaMAPK9OE1：157上调，336下调；WTvsVaMAPK9OE3：155上调，338下调；WTvsVaMAPK9OE4：148上调，345下调。对不同比较组差异基因交集与特异性表达模式系统分析，这些共有基因在葡萄愈伤低温胁迫应答中发挥基础作用。

结合GO、KEGG富集分析解析葡萄愈伤低温应答分子调控机制。GO富集（图6C）显示差异基因显著富集于氧化还原酶活性（41个基因，log₁₀(Q)=6.69），尤其作用于分子氧作为配体供体的酶（EC:1），提示过氧化物酶、SOD等编码基因通过清除ROS维持氧化稳态。外源物质跨膜转运生物学过程显著富集（24个基因，log₁₀(Q)=4.55），暗示参与毒性物质外排、激素介导的低温信号转导。KEGG通路分析（图6D）显示代谢通路（77基因，log₁₀(Q)=5.38）、类黄酮生物合成（9基因，log₁₀(Q)=3.08）显著激活，证明抗氧化代谢网络协同应答。植物激素信号转导通路虽然富集未达到严格显著性阈值(log₁₀(Q)=0.64)，但该调控网络仍具备生物学意义。综上，葡萄愈伤应对低温采用多层级策略：强化ROS清除系统、激活异源物质外排，建立次生代谢激素信号协同调控网络。

基于归一化FPKM值、层次聚类绘制表达热图，野生型与低温处理过表达株系(VaMAPK9OE1、3、4)差异基因表达模式区分明显。差异基因在代谢通路、类黄酮生物合成、植物激素信号转导等关键KEGG通路非随机富集（附图S8）。红色代表高表达，蓝色代表低表达。

进一步验证类黄酮生物合成、植物激素信号转导通路对低温的应答。类黄酮通路（图6E）鉴定7个差异基因：查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI、黄烷酮3羟化酶F3H、肉桂酸4羟化酶C4H、花青素合成酶ANS、无色花青素还原酶LAR1、花青素还原酶ANR。其中VIT_216s0098g01150（VvC4H）表达水平极高。VvC4H介导苯丙烷代谢生成类黄酮、花青素，清除ROS，提升抗氧化酶活性；降低MDA含量，缓解膜脂过氧化，稳定质膜。既维持VaMAPK9激酶活性与信号转导，又保护膜受体、MAPK通路核心组分，形成VvC4HVaMAPK9协同调控模块，是葡萄低温胁迫核心防御机制，显著提升抗寒性。

激素信号转导通路（图6F）识别7个差异基因，包括生长素早期应答SAUR蛋白、2个生长素应答IAA蛋白、生长素响应因子ARF、油菜素内酯受体BRI1、茉莉酸信号抑制子JAZ、DELLA、PR1蛋白。野生型中VIT_206s0004g08150（VvSAUR36）高表达。感知低温信号后VaMAPK9被激活，上调VvSAUR36转录；VvSAUR36调控低温信号模块，增强抗氧化能力，稳定细胞骨架，维持信号通路完整，最终构建高效抗寒调控网络。说明VaMAPK9很可能通过调控这两个关键代谢、信号通路内关键基因应答低温胁迫。

 

 

2.8低温下VaMAPK9过表达愈伤差异基因qRTPCR验证

选取代谢通路、类黄酮合成、激素信号转导通路12个关键差异基因做qRTPCR验证，qRTPCR表达模式与转录组测序结果一致。

 

2.9VaMAPK9互作蛋白筛选与鉴定

将重组质粒pGBKT7VaMAPK9转化Y2HGold酵母感受态。在四缺培养基SD/Trp/Leu/His/Ade上无菌落生长，证明VaMAPK9不存在自激活活性（附图S10）。利用pGBKT7VaMAPK9诱饵筛选葡萄cDNA文库，筛选得到互作蛋白生物素羧基载体蛋白VaBCCP2（附图S11）。点对点酵母双杂交：共转化pGBKT7VaMAPK9与pGADT7VaBCCP2；设置阳性对照pGBKT753+pGADT7T，阴性对照pGBKT7Lam+pGADT7T。在添加Xαgal的四缺平板长出蓝色菌落，证明VaMAPK9与VaBCCP2存在特异性蛋白蛋白互作（图7B）。荧光素酶互补实验LCA结果显示，共表达VaMAPK9N端与VaBCCP2C端的实验组荧光素酶活性显著高于各个对照组（图7C），证明二者发生物理互作，协同参与葡萄低温胁迫适应。

检测转基因愈伤、瞬时转化葡萄叶片中VaBCCP2表达。低温处理后，VaMAPK9OE转基因愈伤VaBCCP2表达显著高于野生型（图7E）；VaMAPK9RNAi愈伤VaBCCP2表达显著下降（图7F）。葡萄叶片瞬时转化结果同样：VaMAPK9OE叶片VaBCCP2显著上调，VaMAPK9RNAi沉默后表达下调（图7G）。BiFC双分子荧光互补实验验证植物体内互作。将VaMAPK9nYFP与VaBCCP2cYFP融合载体共同农杆菌转化烟草叶片表皮细胞，在细胞核、细胞膜位置均观察到清晰黄色YFP荧光信号。两组阴性对照（VaMAPK9nYFP+空cYFP；空nYFP+VaBCCP2cYFP）均没有明显荧光背景（图7D）。综合以上结果证明，活植物细胞内VaMAPK9和VaBCCP2可以直接、特异性互作，重构YFP荧光蛋白活性。

 

 

结论

 

本研究构建了VaMAPK9参与山葡萄低温胁迫、调控抗寒性的分子网络模型。MAPK家族低温表达谱分析发现VaMAPK9受低温特异诱导显著上调；蛋白亚细胞定位主要位于细胞质。在葡萄愈伤组织、葡萄叶片、模式植物拟南芥多个系统开展功能验证，VaMAPK9通过两条协同通路提升植物抗寒性：激活经典低温感知ICECBF信号通路，调控一系列低温响应基因表达；促进类黄酮等抗氧化物质生物合成，有效缓解低温造成的氧化损伤。

本研究首次揭示脂肪酸合成关键蛋白VaBCCP2和VaMAPK9存在蛋白互作，打通低温信号转导和膜脂代谢调控之间的分子联系，为解析植物低温下维持细胞膜结构功能稳定性提供新机制。本研究拓展植物低温应答调控网络，为抗寒果树分子育种提供重要基因资源与策略。利用VaMAPK9VaBCCP2模块开展遗传改良，有望创制兼具高效信号转导与多层生理保护的葡萄抗寒新种质。