文献解读 1207 Food Chem：十四种葡萄酒乙基酯可替换为结构更简单的酯类载体，该替换不会降低品质，但会使香气浓度升高

文献解读  1207

十四种葡萄酒乙基酯可替换为结构更简单的酯类载体，该替换不会降低品质，但会使香气浓度升高

期刊：Food Chemistry（10.4）

发表日期：2020年03月

 

 

研究摘要

 

本研究在模拟红葡萄酒的复杂混合体系中，探究各类单一乙酯的香气贡献。配制参照组V1，体系中14种乙酯采用葡萄酒实际样品中的浓度，再制备多组简化香气向量V2-V7，这些向量与参照组等香气强度、定性感官特征相近，但所含酯类物质数量更少。将简化香气向量添加至两种重构葡萄酒体系，验证简化向量能否替代V1且不损害葡萄酒品质。在年轻葡萄酒模拟体系中，V1可由仅含3种香气活性物质（2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯）的向量完成替代。在橡木风味葡萄酒模拟体系中，仅含有2-甲基丁酸乙酯的向量V7就可以替代V1，且感官上未察觉明显差异。结果同时表明，亚阈值、近阈值香气物质对混合物整体香气强度起到十分关键的作用，当对香气向量做组分简化时，若要维持原有香气向量的香气强度，必须提高香气活性物质的总添加量。

 

研究背景

 

几十年来，乙酯因自带清新果香，被视作葡萄酒中一类重要香气物质。绝大多数乙酯由酒精发酵阶段酵母代谢产生的脂肪酸经酯化反应生成，是发酵饮料风味体系中规模最大、最重要的一类化合物。研究表明，除去乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯这类大宗酸对应的乙酯，葡萄酒中约含有14种乙酯，它们的香气描述略有差异，既包含直链、支链脂肪酸乙酯，也包含部分羟基酸乙酯。值得注意的是，其中仅有部分物质的浓度达到或接近各自的感官阈值。

红葡萄酒的品质与其红浆果、黑浆果香气特征密切相关，黑莓、黑醋栗香气尤为关键。多项研究证实，这类浆果香气来自果香酯类与其他香气物质的相互作用，典型物质包括二甲基硫醚、多官能硫醇以及葡萄酒其他基础香气向量。还有研究探讨，浆果香气是否由特定乙酯组成模式造就，该模式中包含部分处于亚阈值浓度的香气物质。但应当注意，部分研究结论很难实现完全普适，因为这些结论基于阈值附近开展的实验，而阈值条件下超加和、协同效应更容易发生，另外一部分结论来自仅添加酯类的简单香气溶液，体系缺少葡萄酒其他主要香气组分。

葡萄酒含有数量庞大的香气物质，同时存在大量非线性、难以预判的感官互作。与此相反，已有研究提出，各类乙酯会协同整合，构成香气向量。组分间整合程度很高，以至于很难分辨单一酯类带来的细微香气差异。基于以上研究背景，本研究的主要目的为：证明微量酯类物质带来的特有细微香气，对葡萄酒整体香气感知的影响很小（即便存在影响）。在香气模拟建模工作中，可以将乙酯视作一个完整的香气向量，该向量传递通用的酯类果香特征，能够由少数几种香气物质组成的简单混合物、甚至单一香气活性物质等效代表。

 

材料与方法

 

2.1.化学品与标准品

 

2.2.葡萄酒模型的制备

2.2.1酯类的纯化

商用乙酯标准品使用5%碳酸氢钠溶液洗涤，除去脂肪酸杂质。GC-FID校验纯度＞96%。

 

2.2.2.制备具有不同酯类数量的等强度载体

首先制备了V1向量，其中包含了在西班牙红葡萄酒中自然存在的14种ethyl酯（表1）。随后，进一步开发了更简单的溶液，其中含有的酯类数量逐渐减少（分别命名为V2、V2′、V3、V4、V5、V6和V7，表2）。这些简化后的向量是通过以下步骤构建的：首先选择要去除的酯类，然后调整混合物的浓度，使其气味强度与V1相当，最后调整保留的酯类的比例，以尽可能接近V1的香气特性。为了抑制酯水解产生有香气的游离脂肪酸，将纯酯溶液配于pH6.0的1%水-乙醇溶液。

 

 

 

2.2.3.葡萄酒模型（WM）的构建

年轻红葡萄酒模型：葡萄酒冻干非挥发基质+香气成分（表3）。

橡木型红葡萄酒模型：在年轻酒基础上增加橡木类香气物质（愈创木酚、威士忌内酯等），香气背景复杂度更高。

两种基础酒样，一种模拟新酿红葡萄酒，另一种模拟橡木风味葡萄酒，分别添加一种酯类载体（V1、V2′、V3、V4、V5、V6或V7）。总共配制了十种葡萄酒模型，其中六种为新酿红葡萄酒模型（W-V1、W-V2′、W-V3、W-V4、W-V5、W-V6），四种为橡木风味红葡萄酒模型（oW-V1、oW-V5、oW-V6、oW-V7）。葡萄酒模型的最终乙醇含量调至12%，pH值设为3.5。

 

 

2.3.感官评价

（1）气味强度评估：使用1-丁醇建立参考标尺，13 cm线性标度测定香气感知强度

（2）通过三角试验来评估隔离状态下向量的感官差异：对V1与简化向量（V2′-V7）之间的整体感官差异进行评估时，采用了三角测试法。总共进行了六次比较（表4中的A.1至A.6），通过将较简单的向量与V1进行对比来进行测试（V1与V2′；V1与V3；V1与V4；V1与V5；V1与V6；V1与V7）。

（3）通过三角试验评估红葡萄酒模型中由载体引起的感官差异：共准备了十种葡萄酒模型，这些模型以基础葡萄酒为基底（表3），并添加了几种等强度的酯化载体成分（V1、V2′、V3、V4、V5、V6和V7）。其中，有六种模型模拟年轻红葡萄酒的口感（W-V1、W-V2′、W-V3、W-V4、W-V5和W-V6），四种模型模拟橡木桶陈酿红葡萄酒的口感（oW-V1、oW-V5、oW-V6和oW-V7）。实验步骤：在第一组五次三角测试中，将含有最复杂向量（W-V1）的新红葡萄酒模型，与含有从W-V2′到W-V6等较简单向量的新红葡萄酒模型进行对比（表4中测试B.1-B.5）。在第二组三组三角测试中，含有最复杂向量的橡木红葡萄酒模型（oW-V1）与更简单的橡木红葡萄酒模型W-V5至W-V7进行对比（表4中测试C.1-C.3）。

 

 

结果与讨论

 

3.1.酯类标准品纯度验证

香气模型实验必须使用无嗅觉杂质的纯标准品，杂质会对实验结论造成干扰。本研究采用5%碳酸氢钠溶液对商用标准品进行预纯化，去除痕量脂肪酸，以此获得高纯度酯类标准品。此外，为防止纯化后的酯发生自发水解并生成微量酸类物质，将纯酯标准品配制于pH6.0的1%水-乙醇溶液中保存。利用纯化后的酯标准品，对文献报道的感官阈值开展部分复核，排查是否存在较大偏差。针对2-甲基丁酸乙酯与3-甲基丁酸乙酯，本研究重新测定了其感官阈值（表1）。

 

3.2.乙酯香气向量的构建及其在红葡萄酒模型中的效果研究

本研究核心目的：探究普通葡萄酒中的14种果香乙酯，是否可以替换为组分更少的简化酯类香气向量，同时不损害葡萄酒感官品质。为此构建向量V1，其中14种乙酯采用西班牙市售葡萄酒的最高检出浓度。V1用于重构果香乙酯处于最高水平的虚拟红葡萄酒。实验第一步，构建组分数量少于V1，但香气强度、感官品质相近的香气向量（采用三点检验A.1-A.6进行评价，表4）。随后将简化向量添加至重构葡萄酒模型，通过三点检验评估其所带来的感官差异（年轻红葡萄酒模型：B.1-B.6；橡木风味红葡萄酒模型：C.1-C.3，表4）。

 

3.2.1由V1简化得到V2与V2′

第一轮简化（V1→V2），剔除V1中8种浓度低于气味阈值的酯类（表1），V2仅保留6种酯。被剔除的8种酯中，4种（丙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯）处于近阈值浓度，另外4种浓度比对应阈值低一个数量级以上。气味活度值（OAV）不直接表征感官响应，仅用于表达香气物质的相对浓度，被剔除组分的总OAV贡献为2.3，仅占V1总OAV的1.2%，OAV计算结果见表5。实验初期小幅提高V2中剩余香气物质的浓度，补偿“香气损失”，保证V2总OAV不低于V1。即便如此，简化向量V2的香气强度为6.14，显著低于V1的7.68（F=5.86，P<0.01）。因此制备向量V2′，将其香气物质浓度在V2基础上提高50%，使之香气强度与V1匹配。V2′总OAV达到305，较V1高出50%以上（表5）。V2′与V1等香气强度（V1为6.76，V2′为6.77，F=0.522，P=0.792）。

 

 

进一步验证V2′能否在葡萄酒体系中替代V1。构建两组半合成葡萄酒模型（WM）进行对比，模型直接加入取自真实红葡萄酒的非挥发性基质，再添加表3上半部分所列香气物质，分别搭配乙酯向量V1或V2′。两组红葡萄酒模型W-V1与W-V2′仅酯类组成不同，开展三点检验。如表4（测试B.1）所示，二者不存在显著感官差异（P>0.05）。该结果说明在本实验葡萄酒体系条件下，V1简化为V2′不会产生可被察觉的感官差异。在此基础上，继续开展更进一步的向量简化。

 

3.2.2由V1简化得到V3

为进一步减少组分数量，同时将感官变化控制至最低，简化后的混合物必须完整保留原始V1及其第一版简化产物V2′的全部核心香气特征：果香、苹果香、草莓香。V2′的6种组分，依据香气特征大致可归为两组：丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯，共同呈现草莓香、甜香、泡泡糖香气；2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯，共同带有苹果香气。基于此，制备仅含4种组分的V3，剔除2-甲基丙酸乙酯与3-甲基丁酸乙酯，调整剩余物质浓度，尽可能从定性、定量层面复现V1的香气特征。

等强度评估：对比V2′，V3中己酸乙酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯浓度下调，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯浓度大幅提升。如表5，V3总OAV与V2′十分接近。V3香气强度为6.82，与V1（6.76）、V2′（6.77）均无统计学显著差异（F=0.522，P=0.792）。

对红葡萄酒模型的影响：采用三点检验评价V1与简化向量V3之间的感官差异（表4，测试A.2），V1和V3没有显著差异（P>0.05）。对W-V3与W-V1开展三点检验（测试B.2），两款葡萄酒模型感官无显著差异（P>0.05，表4）。继而开展下一步的向量简化。

 

3.2.3由V1简化得到V4

等强度评估：剔除2-羟基-4-甲基戊酸乙酯，得到仅含3种组分的V4。该步骤无需改变物质之间的相对配比，V4中三种香气物质维持V3的比例，整体浓度小幅上调6%-7%。V4的OAV与V2′、V3接近（表5），香气强度为7.43，和V1（6.77）、V2′（6.77）、V3（6.82）均无显著差异（F=0.522，P=0.792）。

感官品质评估：进一步删减组分的前提，是简化混合物要完整保留V1、V2′、V3的核心香气特征：果香、苹果香、草莓香。V3四个组分的香气特征分别为：丁酸乙酯（草莓、甜香、泡泡糖），2-甲基丁酸乙酯（苹果、黑莓），己酸乙酯（草莓、果香）（表1）。因此预期剔除2-羟基-4-甲基戊酸乙酯（果香、草莓、黑莓）不会带来明显感官变化。三点检验结果表明V1和V4无显著差异（P>0.05，表4，测试A.3）。

对红葡萄酒模型的影响：W-V4和W-V1开展三点检验（测试B.3），葡萄酒模型之间感官无显著差异（P>0.05，表4）。继续推进简化实验。

 

3.2.4由V1简化得到V5和V6

等强度评估：构建两组二元向量V5、V6，二者均保留2-甲基丁酸乙酯，分别剔除丁酸乙酯或己酸乙酯。提高剩余组分浓度，维持等香气强度。V1（6.76）分别与V5（6.93）、V6（7.07）的香气强度无显著差异（F=0.522，P=0.792）。由表5可见，V5、V6的OAV达到V1的两倍以上，相比V2′、V3、V4分别高出约1.5倍、1.6倍。

感官品质评估：从理论预判，简化至两种组分难度会大幅提升，因为V4中任意一种物质被去除，都必然会损失混合物的一项核心香气特征（果香、苹果香、草莓香）。即便如此，仍然制备两组二元向量V5、V6。为获得香气品质与V1差异最小的方案：V5中将丁酸乙酯浓度上调15%，V6中将己酸乙酯上调28%。两组向量中的2-甲基丁酸乙酯则分别上调39%、50%。保证与V1等香气强度后开展三点检验。意外的是，评价员无法对V5、V6与V1做出显著性区分（P>0.05，表4，测试A.4、A.5）。

对红葡萄酒模型的影响：向量单独测试条件下V5、V6和V1无显著差异，但置于葡萄酒模型基质中，W-V1与W-V5（P<0.01）、W-V1与W-V6（P<0.01）均检出显著感官差异（表4，测试B.4、B.5）。为探究该品质差异是否会在更复杂的香气背景下被掩盖，制备另一款重构葡萄酒模型：基质与年轻红葡萄酒接近，但添加橡木浸出物，添加量处于葡萄酒正常含量区间（表3）。在该橡木风味模型中，oW-V1分别和oW-V5、oW-V6开展三点检验，未观测到显著差异（表4，测试C.1、C.2）。

 

3.2.5由V1简化得到V7

等香气强度评估：最后得到仅含单一组分的向量V7，只含有2-甲基丁酸乙酯。为达到与V1相近的香气强度，该物质浓度提升至1.7 mg/L（表2），约为V5、V6中该物质浓度的两倍，OAV达到867（表5）。尽管OAV数值差距巨大，V1（6.76）和V7（6.80）的等香气强度得到统计学验证（F=0.522，P=0.792）。

感官品质评估：与V5、V6的规律类似，继续删减组分，预计会带来明显的香气品质改变。2-甲基丁酸乙酯是唯一同时兼具果香、苹果香、草莓香三类香气描述的物质（表1）。向量V7单独测试时，与V1存在显著感官差异（P<0.05，表4，测试A.6）。

对红葡萄酒模型的影响：由于V7在纯向量条件下已经和V1存在显著差异，因此没有开展W-V1与W-V7的对照测试，可以推测在年轻红葡萄酒模型W-V7体系中同样会出现显著感官差异。转而在更为复杂的橡木风味红葡萄酒模型中开展验证，将oW-V1与oW-V7进行三点检验。虽然纯向量V1、V7之间存在差异，但在带有橡木香气的葡萄酒模型体系中，oW-V7和oW-V1无显著感官差异（表4，测试C.3）。

 

讨论

 

4.讨论

4.1乙酯多样性对葡萄酒整体香气品质的影响

第一个显著且出乎意料的结果是：在pH=6的水-乙醇体系中单独嗅闻时，除V2′与V7外，V1与其余简化香气向量之间的香气相似度很高（表4，测试A.2-A.5）。但综合全部对比实验结果可以看出，总体上简化向量与V1仍存在显著差异（P<0.01）。第二个值得关注的现象：评价员在Vi-Vi-V1实验组（复杂样品V1为异常样）中更难分辨出差异，而在V1-V1-Vi实验组中更容易分辨差异。以上两项结果说明，剔除次要香气物质会产生细微、不易被察觉的感官差异。

将乙酯香气向量添加至年轻红葡萄酒模型的实验结果（表4，测试B.1-B.5）表明，仅有V2′、V3、V4能够替代V1，且不会带来可感知的感官变化（P>0.05）。但在橡木风味红葡萄酒模型中，V5、V6、V7同样可以完成替代，且无明显感官差异（表4，测试C.1-C.3）。这意味着，在年轻红葡萄酒模型中，14种乙酯混合物可以仅用3种乙酯（丁酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯或3-甲基丁酸乙酯）替代，而在带有橡木香气的红葡萄酒模型中，甚至仅需1种乙酯（2-甲基丁酸乙酯或3-甲基丁酸乙酯）即可等效替代。

水-乙醇体系的实验结果，从感官品质层面可用优势理论解释混合物中不同乙酯之间的香气互作。该理论认为，混合物的香气特征与体系内香气强度最高组分的香气十分接近。如表5所示，2-甲基丁酸乙酯与3-甲基丁酸乙酯香气特征高度相似，二者可以相互替代，是混合物中香气贡献最高的物质，其余组分仅提供非必需的次要香气细节。尽管完整混合物V1与各单体组分相似度很高，但在水-乙醇溶液中，人们依然可以分辨出乙酯混合物中的部分单体。然而，当向体系添加其他物质构建葡萄酒基质后，这些单体不再以独立的形式被感知，而是形成一个关键感知集合，即“果香”概念。在红葡萄酒模型中，剔除乙酯混合物中的次要组分会造成“果香”感知完整性部分缺失，进而产生显著感官差异。“果香”概念假说认为，乙酯的香气特征只有和葡萄酒中天然共存的其他香气物质共同存在时，才能得到完整表达。但在橡木风味红葡萄酒模型中，V1与V5、V6之间的感官差异消失（表4，测试C.1-C.2），原因在于该体系的主导感知不再是“果香”，而是“木香”。Atanasova等人（2005）曾报道木香香气往往会压制果香，但该研究仅基于二元混合溶液，该结论能否推广到更复杂的体系，还需要开展更多针对性研究。

无论如何，实验结果表明，原始混合物部分次要香气特征的感知高度依赖香气背景。过于简单的香气背景（如水-乙醇体系），会降低人对细微香气差异的分辨能力，而背景环境过于复杂时，这些细微差异又会被完全掩盖。由此得到一条实践启示：香气物质或风味组分的作用，必须在成品基质条件下开展验证，在简单香气体系中观测到或者被忽略的差异，不一定会最终体现在整体感官感知上。而本研究最重要的推论，就是证实香气向量作为感知单元客观存在。

 

4.2乙酯多样性对葡萄酒整体香气强度的影响

第三个重要结果：亚阈值、近阈值香气物质对混合物香气强度的贡献不可忽视。证据来自V1简化为V2时，仅仅剔除低于感官阈值的物质，混合物香气强度就出现明显下降。这类香气增强效应，在心理物理学中称为超加和效应。但本实验中被剔除的另外7种物质，究竟贡献了何种特殊香气特征尚不明确，有待进一步专门研究。

第四个重要发现：香气向量的简化过程，剩余香气物质的浓度提升幅度，远高于简单等比例替换所需的水平。表5中气味活度值（OAV）持续大幅升高印证了这一点。例如简化程度最高的V7，OAV达到V1的4.4倍。香气向量简化，必然需要提高香气物质的总添加量。需要说明，本研究所用到的大部分阈值引自文献，本实验评价小组仅做了部分复核，不可避免存在一定不确定性。但即便假设本实验评价小组测得的己酸乙酯、丁酸乙酯阈值比文献报道低10倍，本研究的核心结论依然成立。

该现象是香气物质浓度-感知强度心理物理函数的固有特性。描述心理物理香气感知强度与刺激物浓度对数关系的函数呈S型，可采用Chastrette、Thomas-Danguin与Rallet（1998）提出的公式描述。该函数的一阶导数（对应图1C对数坐标、图1D线性坐标的曲线斜率），在浓度很低的时候取得最大值，并且会随着浓度C升高持续降低。这意味着：香气物质浓度越高，想要获得同等幅度的感知强度提升，就需要更大幅度提高物质浓度，对应的OAV也随之大幅升高。值得注意，无论混合物内部香气物质之间属于何种互作类型，该规律均成立。除少数折中效应（混合物强度低于体系中最强单体物质的强度）的特殊情况外，次加和、完全加和、超加和（协同）体系均会表现出该规律。当然，加和程度越高，简化向量与原始复杂向量之间OAV的差距就会越大。该现象带来一条重要实践启示：OAV存在较大局限性。它既难以准确判断单一物质在混合物中的实际贡献，也不能直接作为香气向量组合的评判标准。应当优先采用香气感知强度作为评价参数，建议测定主要香气物质的心理物理响应曲线，研究嗅觉信号的加和规律。同样需要谨慎看待阈值条件下开展的实验，阈值附近香气物质更容易发生各类互作效应。

 

 

结论

 

实验结果表明，含有葡萄酒最高检出水平14种乙酯的香气向量，与其他等香气强度、组分简化的香气向量之间的感官差异，仅在特定香气背景条件下才能够被识别。单独嗅闻香气向量本身时，差异几乎无法察觉。置于年轻红葡萄酒基质中，仅含1-2种组分的简化向量就很容易被分辨出来，但在带有橡木香气的红葡萄酒体系中，人们感知不到明显差异。从实际应用角度，年轻红葡萄酒中，14种乙酯混合物可以很好地由3种乙酯替代，当体系存在橡木香气时，甚至可以只用原始向量中香气最强的那1种乙酯。该结果对部分文献提出的“某些微量乙酯、特定对映异构体对葡萄酒特征香气起到关键作用”的观点提出质疑，同时证实开展超阈值条件下、与目标产品接近的复杂混合体系实验十分必要。

尽管如此，本研究证实亚阈值、近阈值香气物质，对混合物整体香气强度起到十分关键的作用。同时发现，想要维持香气向量的香气强度，在简化组分的同时必须提高香气物质的添加量（以OAV衡量）。研究表明该现象是心理物理幂函数的固有特点，也进一步证明OAV在评判物质贡献、构建香气向量方面的局限性。

最后，14种化合物的嗅觉信号实际上可以整合为一个具备3个甚至仅1个维度的香气向量。这说明可以将香气向量作为承载特定定性信息的基础感知单元，对复杂气味混合物开展解析与建模。本研究为香气向量的客观存在提供了概念验证，对食品与香料行业具备普遍参考价值。

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