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【Hortic Res】中国农大潘秋红团队揭示VvMADS模块偶联类胡萝卜素代谢与ABA合成促进葡萄降异戊二烯积累的机制
发布时间：
2026-10-31
来源：
植物科研进展
降异戊二烯是葡萄与葡萄酒花果香气的关键物质，源于类胡萝卜素氧化裂解。协调类胡萝卜素合成、代谢流分配与ABA合成的上游转录调控机制长期不明，制约葡萄香气品质改良。
2026年10月23日，《Horticulture Research》在线发表了中国农业大学潘秋红团队完成的题为“A VvMADS module links carotenoid metabolism with ABA biosynthesis to promote norisoprenoid accumulation in grape berry”的研究论文。该研究发现VvMADS4与VvTM6独立促进降异戊二烯积累且共表达协同增效；VvTM6直接激活VvNXD1启动子，将代谢流导向新黄质与降异戊二烯，VvMADS4经K结构域互作增强其激活，VvMADS2直接激活VvNCED1偶联ABA与香气积累，揭示了整合类胡萝卜素代谢与ABA合成的分级MADS调控模块。
▎1. VvMADS4与VvTM6独立促进葡萄浆果降异戊二烯积累
研究在巨峰葡萄浆果瞬时浸润与愈伤稳定转化体系中过表达VvMADS4和VvTM6，二者均显著促进(E)-β-突厥烯酮、β-紫罗兰酮等多个降异戊二烯组分的积累；VvMADS4表达与浆果发育中(E)-β-突厥烯酮积累正相关（r = 0.77），VvTM6则与10个降异戊二烯组分相关性大于0.6。序列分析显示VvMADS4（242个氨基酸）与VvTM6（225个氨基酸）均为典型MIKC型MADS-box转录因子，VvTM6定位于细胞核；系统进化分析将二者分别归入SEP3与AP3亚家族。二者在花和果实中高表达并在转色期出现表达高峰，提示其作为发育调控的转录因子协调成熟程序与香气积累。值得注意的是，愈伤中未检测到VvCCD4a/4b转录本，唯一可检出的VvCCD1亦未被诱导，表明VvMADS4的促积累效应无法仅以其对VvCCD4b的转录抑制解释（图1A-I）。
图1 VvMADS4与VvTM6的功能验证与分子表征。(A) 巨峰葡萄浆果浸润前后表型；(B) 浆果瞬时过表达的qPCR验证；(C) 瞬时转化浆果中降异戊二烯显著积累；(D) 过表达VvMADS4或VvTM6的稳定转基因愈伤表型；(E) 稳转愈伤降异戊二烯香气图谱；(F) MADS结构域多重序列比对；(G) VvTM6定位于烟草表皮细胞细胞核，标尺 = 20 µm；(H) MADS-box蛋白系统进化分析；(I) VvMADS4与VvTM6在浆果17个发育时期的表达模式
▎2. VvMADS4与VvTM6协同上调类胡萝卜素、ABA与降异戊二烯合成基因
转录组分析显示，OE-VvMADS4与OE-VvTM6差异表达基因中上调基因分别占70.4%和61.1%，两套过表达数据共享678个共调控基因；对这678个基因在两类过表达材料中的log₂FC做线性回归，呈显著正相关（R² = 0.7046，r = 0.8394），表明二者采用趋同的转录调控模式激活下游合成基因。KEGG富集分析显示差异基因显著富集于类胡萝卜素生物合成与植物激素信号转导通路，VvPSY1、VvNXD1与VvNCED2在两类过表达材料中一致上调，VvNCED1则下调。代谢层面，OE-VvMADS4新黄质含量与ABA含量显著升高，OE-VvTM6的β-胡萝卜素降低、叶黄素占总类胡萝卜素比例持续升高而ABA无显著变化，表明两个转录因子趋同地促进类胡萝卜素向下游氧化产物转化（图2A-G）。
图2 VvMADS4与VvTM6共调控基因的筛选与功能表征。(A) 过表达株系差异表达基因统计；(B) Venn图展示678个共调控基因；(C) 678个重叠基因log₂FC的线性回归分析；(D) 类胡萝卜素合成与降异戊二烯代谢通路示意图；(E) 通路关键基因差异表达热图；(F) 稳转愈伤类胡萝卜素靶向代谢组分析；(G) 过表达株系ABA含量
▎3. VvTM6直接结合并激活VvNXD1启动子，重塑类胡萝卜素代谢流
酵母单杂交筛选显示，在VvMADS4与VvTM6中仅VvTM6能够结合VvNXD1启动子，二者均不结合VvPSY1、VvBCH2、VvZEP2、VvNCED1或VvNCED2启动子。VvNXD1启动子在ATG上游853 bp处含一个CArG-box，双荧光素酶实验证实VvTM6显著激活VvNXD1驱动的报告基因表达。在愈伤中瞬时过表达VvNXD1（约6倍）显著提高新黄质含量并降低紫黄质，随之(E)-β-突厥烯酮显著积累，而源自其他类胡萝卜素底物的降异戊二烯明显减少，表明VvNXD1以牺牲其他分支为代价将代谢流导向新黄质分支，重塑降异戊二烯香气组成。此外，过表达VvMADS4显著提高VvTM6转录水平，但酵母单杂交未检测到二者与彼此启动子片段的直接结合（图3A-F）。
图3 VvTM6直接激活VvNXD1，VvNXD1调控类胡萝卜素与降异戊二烯代谢。(A) VvNXD1启动子结构示意图；(B) 酵母单杂交检测VvMADS4与VvTM6对VvNXD1启动子的结合，仅VvTM6表现出结合活性；(C) 双荧光素酶实验验证VvTM6对VvNXD1启动子的激活；(D) 愈伤中VvNXD1瞬时过表达验证；(E) VvNXD1过表达对类胡萝卜素积累的影响；(F) VvNXD1过表达对降异戊二烯积累的影响
▎4. VvMADS4与VvTM6经K结构域互作并在共表达时协同增强降异戊二烯合成
BiFC实验显示VvMADS4与VvTM6在烟草叶表皮细胞核内重建GFP荧光，酵母双杂交经结构域互换规避自激活后证实二者直接互作，截短分析将关键互作界面定位于保守的K结构域。共表达验证中，葡萄叶片单独过表达VvTM6或VvMADS4均提高环氧型降异戊二烯蛇床子烷的积累，共表达时进一步升高，MHO的积累则需要二者共同表达；Micro-Tom番茄果实中共表达协同增强所有检测的降异戊二烯组分，其中β-突厥烯酮在共表达条件下积累最高。双荧光素酶实验进一步显示，VvMADS4与VvTM6共表达时VvNXD1启动子活性显著高于VvTM6单独表达，表明VvMADS4增强VvTM6介导的转录激活（图4A-F）。
图4 VvMADS4与VvTM6蛋白互作验证及其在葡萄叶片和番茄果实中的共表达增强效应。(A) 烟草叶片BiFC实验，标尺 20 µm；(B) 酵母双杂交验证VvMADS4与VvTM6物理互作；(C) 葡萄叶片（Vitis quinquangularis）转基因表达的qPCR确认；(D) 葡萄叶片过表达材料降异戊二烯含量；(E) Micro-Tom番茄果实瞬时过表达RT-PCR电泳验证；(F) 农杆菌浸润番茄果实降异戊二烯图谱
▎5. VvMADS2直接激活VvNCED1并偶联ABA与降异戊二烯积累
以VvMADS4为诱饵的GST pull-down联合LC-MS/MS鉴定到SEP1亚家族成员VvMADS2；酵母双杂交（利用去除C端的VvMADS4s和VvMADS2s规避自激活）证实VvMADS2与VvMADS4及VvTM6分别互作，支持三者形成更高阶复合物。VvNCED1启动子ATG上游2033 bp处存在一个CArG-box，酵母单杂交显示仅VvMADS2能特异性结合VvNCED1启动子-2387至-1735 bp片段，双荧光素酶实验证实VvMADS2显著激活VvNCED1启动子；三因子共表达时启动子活性进一步提高。在巨峰浆果中过表达VvMADS2（约15倍）显著上调VvNCED1转录，同时ABA含量及β-突厥烯酮、β-紫罗兰酮和MHO含量显著升高，表明VvMADS2、VvMADS4与VvTM6均正向调控降异戊二烯积累（图5A-G）。
图5 VvMADS2与VvMADS4、VvTM6互作并激活VvNCED1转录促进ABA与降异戊二烯积累。(A) 酵母双杂交检测VvMADS2与VvMADS4或VvTM6的互作；(B) VvNCED1启动子结构示意图；(C) 酵母单杂交检测三因子对VvNCED1启动子的结合，仅VvMADS2表现出结合活性；(D) 双荧光素酶实验验证VvMADS2对VvNCED1启动子的激活；(E) 巨峰浆果过表达VvMADS2后VvNCED1表达量；(F) ABA含量；(G) 降异戊二烯香气物质含量
▎6. VvMADS模块协调三类代谢通路的工作模型及其对生长素的响应
研究提出工作模型：VvTM6直接激活VvNXD1促进新黄质合成，VvMADS4经K结构域依赖的异源复合体增强其调控效应，VvMADS2直接激活VvNCED1并与VvMADS4、VvTM6互作，将降异戊二烯前体供给与ABA介导的成熟信号偶联。为验证该模块对成熟扰动的响应，研究在转色前施加合成生长素NAA，浆果转色由花后70天推迟至90天；NAA处理推迟了VvMADS4与VvTM6的表达高峰，二者在商品采收期（花后132天）维持较高表达，VvNXD1表达相应延迟，VvNCED1表达的下降亦显著减弱，ABA与β-突厥烯酮的积累峰值延迟且在采收期达到更高水平，而VvMADS2表达不受影响，表明VvMADS4-VvTM6是整合激素信号的动态开关（图6A-B）。
图6 VvMADS介导的类胡萝卜素、ABA与降异戊二烯通路转录协调及其受生长素处理的调控。(A) VvMADS介导转录调控协调三条通路的工作模型；(B) 转色前施加NAA推迟浆果转色与VvMADS4、VvTM6表达高峰，并延缓ABA与β-突厥烯酮的积累峰值，使其在采收期达到更高水平
该研究揭示了一个分级组织的MADS-box模块：VvTM6作为直接DNA结合激活子启动VvNXD1转录，VvMADS4以复合体依赖方式增强其效应，VvMADS2通过激活VvNCED1将类胡萝卜素前体供给与ABA合成直接偶联。与番茄RIN及柑橘中直接结合多个靶启动子的MADS因子不同，葡萄采用了DNA结合与调控功能分离的策略，体现了非呼吸跃变型果实协调激素与代谢的演化多样性。研究还表明降异戊二烯代谢受底物为中心的调控逻辑支配，类胡萝卜素代谢流的重定向而非裂解酶基因的转录激活是香气积累的关键。上述发现为改善葡萄香气品质提供了潜在的分子靶点，也为果实风味育种的精准设计奠定了理论基础。
原文链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhag448
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