刺葡萄米酒酿造用乳酸菌的筛选及应用

 

阮祯祎¹，欧航¹，符小慧¹，向云贵¹

兰晴¹，曾依浓^1，2，方伟^1，2

 

1. 怀化学院 生物与食品工程学院

2. 山地生态食品精深加工湖南省普通高等学校重点实验室

 

 

文献速读

 

摘要：从甜米酒、泡菜、屈氏甜酒曲、黄酒曲、桑叶甜酒曲和发酵乳中分离出108株乳酸菌，经酸和酒精耐受性筛选，并结合体外益生特性评价，菌株TMJ13表现出优良的人工胃液存活率（119.05%，3 h）、人工肠液存活率（276.83%，4 h）、疏水性（40.0%）及抗氧化活性（ABTS自由基清除率80.0%，DPPH自由基清除率88.4%），被选定为刺葡萄米酒酿造用菌株。经16S rDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌。该菌酿制的刺葡萄米酒酸甜协调、风味均衡，感官评分（76.1分）和理化指标均优于对照组，提升了刺葡萄米酒的发酵品质与感官风味，显示出良好的应用潜力。

关键词：益生菌；筛选；刺葡萄；米酒

引用格式：阮祯祎，欧航，符小慧,等.刺葡萄米酒酿造用乳酸菌的筛选及应用[J].农产品加工,2026,(17):89-94.

基金项目：湖南省教育厅重点项目（22A0543）；湖南省大学生创新训练计划一般项目（S202410548074）

PART 01

一    引言

 

 

刺葡萄是中国特有的野生葡萄品种，广泛分布于长江流域及以南地区，其果实富含维生素、白藜芦醇和齐墩果酸等多种营养及生理活性成分。然而，刺葡萄皮厚籽多且不耐贮藏的特性严重制约了其鲜食市场的发展。利用其酿造刺葡萄酒成为提升附加值、推动产业发展的有效途径。

米酒是以大米或糯米为原料经微生物发酵制成的中国传统低度酿造酒，不仅富含碳水化合物、氨基酸、蛋白质、维生素和矿物质，还具有促进消化、抗癌、抗氧化等潜在健康益处。为丰富米酒风味并满足消费者对健康饮品的需求，市场上涌现出多种添加水果、鲜花、中药材等原料的新型米酒。其中，水果型米酒因其独特的风味和香气更受消费者青睐。

益生菌是指可定殖于人体内并改变宿主肠道菌群组成的有益活性微生物。乳酸菌作为益生菌的主要类群，广泛分布于自然环境和发酵食品中，在维持肠道菌群平衡、调节血脂、抗氧化等方面发挥着重要作用。

在米酒发酵中，乳酸菌扮演着关键角色，其代谢产生的乳酸赋予米酒醇厚口感和绵长回味，乳酸酯化形成的乳酸乙酯贡献优雅香气。此外，乳酸菌发酵产生的少量乙酸、甲酸、丙酸、二氧化碳及其他微量醇、醛、酸类物质共同构成了米酒丰富的风味与香气谱。有研究表明，乳酸菌与酵母混合发酵可显著提升米酒的益生特性。特定益生菌（如鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等）的应用不仅能改善米酒口感（如柔和度、酸甜平衡等），还能提升其营养价值并优化风味物质组成（如增加酯类、酮类含量）。

研究在刺葡萄米酒发酵过程中引入益生菌，旨在促进发酵、改善风味，并利用其产生的生物活性物质增强产品健康属性。然而，目前市场上缺乏专用于刺葡萄米酒酿造的优良乳酸菌。因此，研究从不同来源分离乳酸菌，测定其产酸、耐酸、耐乙醇能力，并评估其模拟肠胃液耐受性、疏水性和抗氧化活性益生特性，进而筛选出1株综合性能优良的菌株并进行酿造，生产出色泽诱人、风味独特且感官品质优良的益生菌刺葡萄米酒。

 

PART 02

二   材料与方法

 

2.1 材料与设备

糯米、刺葡萄、桑叶甜酒曲、屈氏甜酒曲、甜米酒、泡菜，均为市售；黄酒曲，湖北安琪酵母股份有限公司提供；发酵乳，实验室至新疆采样保存。

SPX-250BIII型恒温培养箱、DK-98-II型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司产品；UV- 5500型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；G136型高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司产品；PH-10型手持pH计，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；STARTER3100型多参数测试仪，奥豪斯仪器有限公司产品；HNY-2102型恒温培养振荡箱，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；Centrifuge 5804R型高速冷冻离心机、KB3型旋涡振荡仪，德国艾本德公司产品。

2.2 试验方法

2.2.1 菌株的分离与纯化

取黄酒曲、桑叶甜酒曲、屈氏甜酒曲、甜米酒、泡菜、发酵乳样品各2 g，分别接种于40 mL无菌MRS液体培养基中，于37 ℃下培养5 d。培养液经涡旋振荡混匀后梯度稀释，涂布于含1% CaCO₂溶液的MRS固体培养基，再于37 ℃下培养48 h。挑选具透明溶钙圈、边缘整齐的乳白色单菌落，通过平板划线法纯化2次。将纯化菌落接种至10 mL MRS液体培养基中，于37 ℃下培养24 h获得活化菌液。将菌株进行来源编号，采用甘油管保藏法于-80 ℃下保存。

2.2.2 酿酒耐受性初筛

1）产总酸能力的测定。将菌液按2%（V/V）接种量转接至10 mL的MRS培养基中进行活化，于37 ℃下培养24 h。参照GB 12456—2021酸碱滴定法测定总酸含量（以乳酸计）。

2）耐酸性的测定。调节MRS液体培养基至pH值3.0，4.0，5.0，灭菌备用。接种5%（V/V）活化菌液，于37 ℃下培养48 h，以同pH值无菌培养基为空白对照，测定OD₆₀₀值。

3）耐乙醇的测定。配制含4%，6%，8%（V/V）乙醇溶液的MRS培养基。接种5%（V/V）活化菌液，于37 ℃下培养48 h，每12 h测定OD₆₀₀值（以同浓度乙醇溶液的培养基为空白）。

2.2.3 菌株益生特性复筛

1）肠胃液耐受性。参考何杉杉的试验，基于此试验进行调整。配置pH值3的生理盐水、pH值8的PBS缓冲溶液和pH值7.4的PBS缓冲溶液，灭菌。人工胃液（pH值3）和人工肠液（pH值8）需现配现用，以防其中的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐失活。取10 mL活化3代的菌液离心，于4 ℃条件下，以转速8 000 r/min离心5 min，弃上清液，用 PBS缓冲液（pH值7.4）复溶洗涤3次，再加PBS缓冲液振荡均匀制成悬浮液，调节菌体菌落总数至1×10⁸ CFU/mL（OD₅₉₅=1.0）。 

人工胃液的配置：配置0.2% NaCl溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值至3，过滤除菌。取1 mL菌悬液（10⁸ CFU/mL）加入9 mL模拟胃液（终浓度10⁷ CFU/mL），混匀。于37 ℃下静置培养，于0 h和3 h分别取样。用pH值3的生理盐水梯度稀释后，取0.1 mL涂布至MRS琼脂平板，于37 ℃下培养48 h后计数，取平均数计算菌落数和存活率。

人工肠液的配置：配置PBS缓冲溶液，加入0.1%胰蛋白酶和0.3%胆盐，用浓度为0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至8，过滤除菌。取经胃液处理3 h后的菌液1 mL，加入9 mL模拟肠液（终浓度10⁶ CFU/mL），混匀。37 ℃静置培养，于0 h和4 h分别取样。用pH值8的PBS缓冲溶液梯度稀释后取0.1 mL涂布至MRS平板，于37 ℃下培养48 h后计数，以平均数计算菌落数和存活率。

式中：N_m——过模拟胃液0 h和3 h的活菌数；

    N_n——过模拟肠液0 h和4 h的活菌数。

2）表面疏水性。参考宛祎豪等人的试验，基于该试验基础进行修改。取二次活化菌液，以转速 4 000 r/min离心2 min，生理盐水洗涤2次，PUM缓冲液调OD₆₀₀至0.8~1.0。加1 mL正十六烷至3 mL菌悬液，涡旋振荡2 min，立即测OD₆₀₀（A0）；于37 ℃下静置1 h后取水相测OD₆₀₀（A1），计算疏水性。

3）抗氧化活性。参考黄丽衡等人的试验，取二次活化菌液，以转速4 000 r/min离心2 min，生理盐水洗涤2次，用PBS缓冲液调菌悬液OD₆₀₀为0.6~1.0。①试验组：将2 mL菌悬液与1 mL DPPH无水乙醇溶液混匀，于37 ℃下避光反应30 min，以转速6 000 r/min离心10 min，取上清液，于波长517 nm处测定吸光度A1；②空白组：以等体积无水乙醇溶液代替DPPH无水乙醇溶液；③对照组：以等体积蒸馏水代替样品溶液测得A₂，等体积的蒸馏水和无水乙醇混合作为空白A₀。

参考刘思语等人的试验，取二次活化菌液，以转速4 000 r/min离心2 min，生理盐水洗涤2次，用PBS缓冲液调菌悬液OD₆₀₀为0.6~1.0。取1支15 mL离心管分别加入1.6 mL的ABTS工作液和0.4 mL水作为空白组（A₀），再每株菌各取1支离心管加入1.6 mL ABTS工作液和0.4 mL乳酸菌悬液，此为试验组（A₁），将其充分混匀，静置6 min后测定波长734 nm处的吸光度。

2.2.4 菌株分子生物学鉴定

选取综合性能最佳的菌株委托武汉擎科生物有限公司进行DNA提取和测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对分析，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果。

2.2.5 刺葡萄益生菌米酒酿造与评价

选取饱满圆糯米，洗净之后加清水浸泡6 h。将泡好的米沥干水分，蒸20 min，焖5 min；加入适量凉白开水，抓散米粒；待米粒温度降至30 ℃以下，以0.32 g/100 g比例拌入曲，同时加入2%的乳酸菌，以不加乳酸菌的组作为对照。装罐压实，中间通底，于26 ℃下糖化12 h。发酵4 d后按1∶1.5的比例加入凉白开水、15%的刺葡萄，继续发酵至饭90%以上浮起。最后，过滤即可。

酒精度测定参考《酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225—2023）；总糖的测定参考《黄酒》（GB/T 13662—2018）；总酸的测定参考《食品中总酸的测定》（GB 12456—2021）；糖度测定使用手持糖度计；pH值使用手持pH计测量。

感官评价则随机选取20名身体健康、嗅觉味觉灵敏的专业人员组成感官评价小组，对刺葡萄米酒的澄清度、香气、色泽和口感进行评分。汇总所有人的评分结果，计算平均分。

 

PART 03

三  结果与分析

 

 

3.1 菌株的分离与纯化

经过分离纯化，共分离出乳酸菌菌株108株。按照筛选来源不同，将从甜米酒、泡菜、屈氏甜酒曲、黄酒曲、桑叶甜酒曲、发酵乳分离纯化得到的菌株分别以TMJ，PC，QT，QZH，SYQ，RQ进行命名，后加上数字编号便于区分。

3.2 菌株的产总酸能力

从分离纯化得到的菌株中挑选出58株溶钙圈大的乳酸菌，并进行产酸能力试验。分离出的乳酸菌产酸能力总体较强，每株菌株的产酸量都在11 g/L以上。其中，QT3产酸量最高，为17.7 g/L。剔除14株产酸能力较差（<11.7 g/L）的乳酸菌，剩下的44株乳酸菌进行酸耐受性试验（QT3~TMJ35）。

乳酸菌产总酸能力见表1。

3.3 乳酸菌的酸耐受性

米酒发酵过程中，霉菌、酵母、乳酸菌等多种微生物共同作用，会产生大量有机酸，形成酸性环境。因此，目的菌株应具有较好的酸耐受性，以确保菌株能够在发酵过程中存活并发挥作用。

乳酸菌的酸耐受性见表2。

由表2可知，以pH值为3，培养48 h后的吸光度进行排序。酸耐受性测试的44株菌在各pH值下都能存活，具备基础的酸耐受性。在pH值为5时，各菌株OD值基本都在2.10以上。当pH值为4时，各菌株OD值为1.80~2.10。在pH值为4和5时，各菌株生长状况良好，难以看出差异。当pH值降至3时，各菌株产生较大差异，低pH值对菌株生长的限制开始出现。其中，RQ6的OD值最高，为1.33，酸耐受性最强；RQ18的OD值最低，为0.30，受低pH值环境影响最大。pH值为3时，有30株菌的OD值高于0.60。可知大部分菌有较好的酸耐受性。为了保证乳酸菌在米酒发酵中能够稳定生长，选择pH值< 3，OD值> 0.80酸耐受性较好的12株菌（RQ6~QT8）进行后续试验。

3.4 乳酸菌的乙醇耐受性

米酒发酵时，酒精度会随着酵母的繁殖和代谢缓慢增加，从而抑制其他微生物的生长。因此，应用于米酒中的菌株还应具有较强的乙醇耐受性。将酸耐受性较强的12株菌进行乙醇耐受性试验。

乳酸菌的乙醇耐受性见表3。

总体来看，各菌株在不同乙醇体积分数中，0~ 48 h内，随着培养时间的延长，OD值呈先上升后下降再缓慢回升的趋势；0~24 h，由于营养物质充足，菌体快速繁殖，OD值上升；24~36 h，菌群内部生存压力增加，菌体繁殖速度变慢，加上乙醇对菌体的杀灭，OD值不增反降；36~48 h，长时间的乙醇胁迫让菌株开启适应机制[20]，乙醇耐受性增加，OD值开始回升。结果显示，随着乙醇体积分数的升高，各菌株的生长都受到了不同程度的影响。发酵48 h后4%乙醇体积分数下OD值最高为1.99（RQ6）；发酵48 h后6%乙醇体积分数下OD值最高为1.71（TMJ13），发酵48 h后8%乙醇体积分数下OD值最高为1.69（QT16）；其中，11株菌比邹静等人在8%乙醇体积分数下测定的吸光度（1.09）更高。选择同时满足4%乙醇体积分数、发酵48 h后OD值高于1.80，6%乙醇体积分数、发酵48 h后OD值高于1.50，8%乙醇体积分数、发酵48 h后OD值高于1.13的菌株（TMJ4，TMJ6，TMJ13，TMJ28，TMJ43，TMJ45，PC9）共7株菌进行益生特性复筛。

3.5 乳酸菌的肠胃液耐受性

益生菌发挥益生作用的前提是在胃肠液中存活。胃液中的胃酸、胃蛋白酶及肠液中的胆盐、胰蛋白酶等具有杀灭、抑制微生物的作用，是影响乳酸菌存活率的主要因素。

乳酸菌人工胃液耐受性见表4，乳酸菌人工肠液耐受性见表5。

由表4可知，7株菌在人工胃液处理3 h后均具有一定的耐受能力，但差异较大，其中TMJ13的耐受性最高（119.05%），TMJ45的耐受性最低（0.81%）。由表5可知，7株菌在人工肠液处理4 h后的存活率均高于100%，最高为276.83%（TMJ13），最低为131.72%（TMJ43）。此外，因该试验中所有菌经人工肠胃液处理后的菌落数均大于1×10⁶ CFU/mL，故保留全部菌株进行后续试验。

3.6 乳酸菌的疏水性

疏水性是微生物和宿主细胞之间的非特殊相互作用，是黏附能力的一个指标，对于益生菌黏附在胃肠道上皮细胞上至关重要。黏附能力是益生菌在人体肠道内定殖、发挥益生作用的前提。疏水性越高的菌株，黏附能力越强。疏水性判定标准：71%~ 100%为强疏水性，36%~70%为中疏水性，低于35%为弱疏水性。

乳酸菌的疏水性见图1。

由图1可知，TMJ45的疏水性最高（50.6%），TMJ43的疏水性最低（18.0%）。选取疏水性较高的4株菌（TMJ45，TMJ6，TMJ4，TMJ13）进行后续试验。

3.7 乳酸菌的抗氧化活性

DPPH自由基和ABTS⁺自由基的消除率是研究活性物质抗氧化能力和自由基清除能力的重要组成部分。

乳酸菌DPPH自由基、ABTS⁺自由基的抗氧化活性见图2。

由图2可知，DPPH自由基清除率最高为91.0%（TMJ4），最低为68.3%（TMJ45），所有菌株的DPPH自由基清除率均高于60%。ABTS⁺自由基清除率最高为80.0%（TMJ13），最低为39.0%（TMJ4）。结果表明，4株乳酸菌对DPPH自由基和ABTS⁺自由基均具有一定的清除能力。综合人工肠胃液耐受性、疏水性和抗氧化活性的试验结果，最终选择TMJ13作为优质菌株进行后续酿造。

3.8 乳酸菌在刺葡萄米酒中的应用

将来源于甜米酒的TMJ13进行16S rDNA序列分析，经鉴定为植物乳杆菌，并将其加入刺葡萄米酒中进行酿造。

益生菌刺葡萄米酒与对照米酒指标对比见表6。

由表6可知，与未添加乳酸菌的刺葡萄米酒相比，酿制出的米酒酸甜适中、醇美厚重、口味均衡，感官评分、酒精度和总酸更高。

 

PART 04

四  结论

 

 

从甜米酒、泡菜、屈氏甜酒曲、黄酒曲、桑叶甜酒曲和发酵乳中共分离出108株乳酸菌。经酸和酒精耐受性筛选，并结合体外益生特性评价，确定菌株TMJ13为优选菌株，分别为人工胃液3 h存活率119.05%，人工肠液4 h存活率276.83%，疏水性40.0%，ABTS⁺自由基清除率80.0%和DPPH自由基清除率88.4%。经16S rDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌。该菌酿制的刺葡萄米酒酸甜协调、风味均衡，感官评分和理化指标均优于对照组，提升了刺葡萄米酒的发酵品质与感官风味，显示出良好的应用潜力。