molecules：多种酵母连续发酵过程中聚合色素形成的影响

多种酵母连续发酵过程中聚合色素形成的影响

期刊：molecules（4.6）

发表日期：2018年

 

 

研究摘要

 

红葡萄汁中的花色苷可能会在酿酒过程和葡萄酒陈酿过程中由于多种不同的原因而演变，颜色的稳定性和演变是一个复杂的过程，可能取决于葡萄品种、酿酒技术、发酵酵母选择、共色素沉着现象和聚合作用。黄烷醇与花色苷的缩合可能与黄酮离子或半缩醛来形成发生，以产生低聚物和聚合物。代谢乙醛的存在增强了反应的动力学，促进了吡喃花色苷型二聚体或黄烷醇-乙基-花色苷结构的形成。非酵母菌能够提供更高水平的颜色强度和更大的聚合色素比例和聚合指数。在连续发酵中选择非酵母菌属增加了葡萄酒中的果味酯，特别是Lachancea thermotolerans和Schizosaccharomyces pombe，并生产出具有潜在色素成分的葡萄酒。

 

研究背景

 

决定红葡萄酒颜色演变和颜色稳定性的因素有很多，包括葡萄品种，酿酒工艺如单宁添加或冷浸渍，选择发酵酵母菌株通过产生代谢物促进稳定色素的形成，或通过酵母细胞壁吸附花色苷和共同色素沉着现象等。

酵母代谢可能导致葡萄汁发酵过程中代谢前体的不同值，以形成吡喃花色苷、低聚物和聚合色素。非酵母菌产生的丙酮酸和乙醛浓度与酿酒酵母不同。与酿酒酵母的纯发酵相比，非酵母酵母发酵过程中产生的稳定色素浓度更高。

尽管黄酮离子的反应性可能与半缩醛形式的反应性不同，但两种分子都与黄烷醇相互作用，形成悬浮液中的低聚物。低聚物色素更稳定，不是因为它们的分子量更大，而是因为花色苷吡喃环中的位置。

这项工作的目的是使用白葡萄汁监测锦葵素-3-O-葡萄糖苷在发酵过程中与四种不同黄烷醇的缩合，纯酿酒酵母培养物作为对照，并用非酵母菌进行连续发酵。该实验设计中测试的黄烷醇是(+)-儿茶素（CAT）、原花青素B2（PB2）、原花青素C1（PC1） 和原花青素A2（PA2）。

 

研究内容

 

1. 酵母菌株和酵母种群生长

将Lachancea thermotolerans（Lt）菌株CHKt 421与酿酒酵母（Sc）菌株7VA和裂殖酵母菌（Sp）菌株938进行连续发酵。

 

2. 校正的酿酒葡萄汁

 

图3. CAT处理的体验式设计

 

Lt-Sc、Lt-Sp和Sc三个不同的试验是由第一期和第二期酵母组合而成的。其他处理（PB2、PC1和PA2）采用相同的设计

 

3. 葡萄酒主要参数

采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）测量了残糖、苹果酸、乳酸、总酸度、挥发性酸度和pH值等主要参数。丙酮酸使用分析仪Y15分析。

 

4. 发酵挥发性化合物

 

5. 色素表征

 

6. 颜色评估、总花色苷和总酚类物质

使用紫外可见光谱仪测定红酒样品的颜色强度（I）和色深（N）、花色苷电离度（α）、总酚类物质（TPI）、化学年龄（ChA）、聚合indeX（PI）、聚合色素（PP）和总色素（TP）。

 

7. 统计分析

 

研究结果

 

1. 酵母生长和代谢物产生

有三种不同的发酵试验，其中一种是Sc的纯培养物，另外两种是Lt+Sc和Lt+Sp的连续发酵。结果发现，在三天内，Sc和Lt分别以6.4×107 CFU/mL和4.5×107 CFU/mL达到最大生长，第7天后Sc群体迅速下降。用Sc进行顺序发酵时，在CAT和PB2处理中观察到轻微的增加和稳定生长，而对于包括Sp在内的其他处理，酵母种群随着时间的推移下降较慢，直到第13天后数量在1×105和1×106 CFU/mL之间，这可能是由于乙醇浓度的增加使得Lachancea属和其他几种非酵母菌难以在发酵时间内存活。

 

图1. 酵母种群增长以及发酵过程中乙醛和丙酮酸的浓度

（a）CAT、（B）PB2、（C）PC1和（D）PA2

 

发酵代谢物的产生跟随动力学生长，在72小时后达到最大浓度。在初始阶段，两种酵母的丙酮酸在所有处理中都达到了最大浓度。在乙醛生成方面，在CAT和PB2处理中观察到纯培养Sc的最大浓度，PC1和PA2的浓度稳定。在所有处理中，酵母Sc和Sp的顺序接种后丙酮酸浓度增加，但纯培养Sc除外。当使用Lt时，乙醛的浓度在初始发酵阶段降低。在连续接种酵母（Sc和Sp）后，乙醛产生增加，并在第9天达到峰值（图1），值约为40 mg/L。

 

2. 乙醇、酸度和糖含量

使用Lt-Sp物种进行的顺序发酵导致残糖高于4 g/L（表1）。酸度差异取决于酵母种类，并且与每次处理中使用的黄烷醇无关。Sc发酵的挥发性酸度和总酸度较高，而Lt-Sp组合浓度最低。Lt-Sp的苹果酸含量在统计学上较低，pH值更高。

 

表1. 葡萄酒样品中的乙醇、酸度和糖含量

 

3. 发酵挥发物

发酵挥发物见表2，分为四类：高级醇、羰基化合物、果味酯和总挥发物。除2,3-丁二醇外，所有试验中高级醇浓度均低于350 mg/L阈值，因此预计它们不会导致葡萄酒的芳香缺陷。发酵Lt-Sc酵母组合产生的总高级醇浓度最高，Sc发酵浓度最低。乙酸乙酯等羰基化合物高于其阈值时，会导致红酒产生异味。乙酸乙酯是一种具有果香的化合物，试验中获得的浓度在24.4±0.1 mg/L和49.4±1.6 mg/L之间，用Lt-Sp组合酿造的葡萄酒较低，而Lt-Sc葡萄酒最高。在二乙酰方面，Lt-Sc具有较高的值，可以提供黄油香气和风味。

 

表2. 通过GC-FID定量的发酵挥发性化合物

 

与Sc葡萄酒相比，Lt-Sp组果味酯的浓度更高，其次是Lt-Sc葡萄酒。与高级醇和羰基化合物一样，果味酯的浓度似乎取决于发酵酵母而不是处理。两种非酵母菌的浓度最高。

总挥发物的浓度主要由2,3-丁二醇组成。在用Lt-Sc发酵的葡萄酒中，总发酵挥发物较高，因为这种酵母产生的2,3-丁二醇的浓度较高，而Lt-Sp葡萄酒中果味酯含量更高。

 

4. 色素的表征

酵母菌株的细胞壁可能在不同程度上吸附花色苷，发酵过程中色素的减少可能取决于所选择的发酵菌株。使用Lt-Sp时观察到锦葵素-3-O-葡萄糖苷和总色素的浓度显著降低（表3）。在初始阶段使用Lt可能导致总色素的第一次减少，随后在用Sp的顺序发酵期间加重。

 

表3. 实验红葡萄酒中发现的色素

 

表3显示了葡萄素和乙烯基酚类化合物中的吡喃花色苷。关于葡萄素含量，所有试验均鉴定出Vitisin B，在处理PA2的顺序发酵试验中，葡萄素的浓度似乎较低（表3）。锦葵素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚分子离子是试验中唯一鉴定出的乙烯基酚类素。Lt-Sp由于缺乏羟基肉桂酸脱羧酶活性而不产生乙烯基酚类物质。

所有样品中都会形成聚合色素（表4）。在CAT处理中，异构体锦葵素-3-O-葡萄糖苷-乙烯基儿茶素和锦葵素-3-O-葡萄糖苷-乙烯基表儿茶素在Sc发酵中浓度相似，而在用Lt-Sp连续发酵中，表儿茶素衍生物的量更高。PB2处理产生的聚合色素浓度略高。

 

表4. 用HPLC-DAD-ESI/MS鉴定的色素，在525 nm处具有DAD信号

 

在PC1处理下，鉴定出3个二聚体和一个三聚体；在Lt-Sp菌株试验中发现的三聚体浓度略高。原花青素C1（三聚体）与锦葵素-3-O-葡萄糖苷直接缩合时未鉴定出色素。第四种处理PA2在纯培养发酵中产生低聚色素浓度最低，特别是发酵菌株Sc。

酵母菌株和不同处理对色素进化和稳定性的贡献可以在图2的PCA图表中看到。两个主成分解释了84.7%的变异性。组分1对锦葵素-3-O-糖苷、总色素和乙烯酚酸有正贡献，而组分2对聚合色素和葡萄素有正贡献。这样，在组分1中观察到三个不同的聚类，其中色素较多的试验位于图表的右侧，对应于使用Sc进行纯培养发酵，而浓度最低的试验位于左侧。关于组分2，可以看出每种发酵培养基的处理对色素形成的贡献，CAT处理在所有三个簇中产生了最高浓度的低聚色素，其次是Lt-Sp试验的PB2处理（图2-左侧），以及试验Sc和Lt-Sc的PC1处理。

 

图2. 主成分分析（PCA）用于实验试验中色素的测定

（1）CAT（2）PB2（3）PC1以及（4）PA2

 

5. 颜色和多酚评估

Lt-Sp发酵的颜色强度和色调显示出更大的值，其他组这些参数的值也略有增加，顺序为发酵酵母Sc < Lt-Sc < Lt-Sp。发酵对Lt-Sp的花色苷电离度（表5）也较高，这意味着具有黄酮形式的色素的比例较高，因此观察到的颜色可能更强烈。用这种技术测量的色素浓度与颜色强度成反比，这意味着用Sc发酵的葡萄酒在发酵结束时含有更多的色素，并且，正如高效液相色谱联合质谱仪所发现的那样，锦葵素-3-O-葡萄糖苷的浓度在这些葡萄酒中更高，其次是使用Lt-Sc的葡萄酒。聚合色素和总色素浓度最低的为Sp发酵。这些值的趋势与色谱观察到的趋势不同，可能是因为紫外-可见光技术的测量范围更大。

 

表5. 紫外可见光测定颜色参数和多酚的结果

 

关于化学年龄（ChA）和聚合指数（PI）（表5），Lt-Sp的值较高，这主要是由于这些试验中低聚色素与总色素的比率更高。Lt-Sp试验的总多酚指数（TPI）值在统计学上存在差异，与其他试验的数值差异略高。

色素和颜色参数的Pearson相关图如表6所示。该图证实了前面讨论的结果。在色素和色素参数方面，锦葵素与乙烯基酚类化合物与大多数指标呈强负相关关系，而锦葵素与总色素指数（TP）呈极强正相关关系。对于葡萄素和低聚物，除聚合色素外，与所有指标的相关性均不显著，这些色素与聚合色素指数（PP）呈强正相关。可以观察到，在发酵结束时观察到的锦葵素和乙烯基酚类物质的量越高，获得的指数就越低。

 

表6. 色素和颜色指数的皮尔逊相关图

 

研究意义

 

在葡萄汁中使用(+)-儿茶素会产生更高浓度的低聚色素，其中大部分与乙醛有关。在顺序发酵中使用酿酒酵母和裂殖酵母在发酵过程结束时增加了乙醛和丙酮酸的产生，从而有可能在此阶段形成稳定的色素。因此，葡萄酒的颜色是单体色素浓度和发酵过程中形成的低聚部分的结果。不同的处理方式，即在发酵前向葡萄汁中添加黄烷醇，似乎对具有相同发酵条件的样品的发酵挥发物产生的代谢途径没有影响，葡萄酒中发酵挥发物的大多数差异都与用于发酵的酵母有关。当使用非酵母时，形成较少的2,3-丁二醇和更多的果味酯。不仅香气特征，而且在葡萄酒中观察到的颜色也因所用发酵菌株的性质而发生变化，其中一些菌株的细胞壁结构可能具有更高的色素吸附。