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Food Res. Int：红酒中高分子质量高分子多酚的化学降解组成表征研究
发布时间：
2024-07-11
来源：
葡萄研究
红酒中高分子质量高分子多酚的化学降解组成表征研究
期刊：Food Research International（7.0）
发表日期：2019年
研究摘要
高分子量聚合物多酚（HPPC）是红酒中的主要多酚类。然而，由于其多样性和结构复杂性，其组成表征仍然是一个困难。本研究采用固相萃取法结合半制备型HPLC从红酒中分离纯化的高分子量聚合物多酚（PHPPCs）。采用不同的化学降解方法（NaOH、HCl和苄基硫醇降解）将PHPPCs分解成低分子量片段。采用HPLC/UPLC−DAD和HPLC-FT-ICR-MS验证了降解片段的化学结构。结果表明，在苄硫醇存在下，通过降解法检测到3种原花青素、5种原花青素、苄基硫醚、槲皮素和15种花青素。通过NaOH降解发现了9个结合的酚酸，通过HCl证明了12个结合的氨基酸。在这些不同的片段中，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷丙酮酸加合物、4种酰化花青素、4种羟基苯基吡喃花青素、槲皮素、原儿茶酸、香草酸和肉桂酸首先在PHPPCs中发现。首次验证了氨基酸作为红葡萄酒中聚合物多酚的组成单位。基于降解片段，推测了红酒中HPPCs的可能组成特征。
研究背景
葡萄和葡萄酒多酚引起了科学界的极大关注，这主要是因为它们潜在的健康益处，以及其对葡萄酒感官特性的巨大贡，包括颜色、风味、苦味和涩味。
葡萄中的多酚主要包括原花青素、花色苷、酚酸、白藜芦醇及其衍生物、黄酮醇和黄酮。红葡萄酒多酚由葡萄多酚和在酿酒过程中衍生的新酚类化合物组成。高分子量聚合物多酚（HPPC）是葡萄和红葡萄酒中的主要多酚。由于复杂的红葡萄酒基质，它们中的大多数被浓缩在模型葡萄酒溶液中以进行结构鉴定，而不是与红葡萄酒分离。迄今为止，人们对红葡萄酒中HPPC的结构组成知之甚少。由于分子量较高且分离效果较差，无法直接进样HPPCs样品，为了表征HPPC的结构，将HPPC降解成小分子片段，然后进行HPLC或MS检测是一种替代方法。
化学水解降解反应通常用于结构研究，将聚合物分解成低分子量的碎片，然后通过合适的分析仪器进行分析。
这项研究首先通过固相萃取和半制备型HPLC制备了PHPPCs，然后使用不同的化学降解方法进行了成分分析。此外，还提出了不同构建块之间的联系。同时，初步探究了不同类型葡萄酒中HPPCs的关键结构特征。
研究内容
1.设备
2.葡萄酒样品
本研究选择了以下陈年单品种红葡萄酒：来自葡萄牙的Tinta Roriz，陈酿7个月（TRP红葡萄酒）；来自葡萄牙的西拉，陈酿7个月（SHP红葡萄酒）；由智利赤霞珠葡萄酿造的红葡萄酒，没有橡木桶陈酿过程（CSC红葡萄酒）；葡萄牙赤霞珠葡萄酿造的红葡萄酒，陈酿12个月（CSP红葡萄酒）。
3.化学试剂
4.从红酒中分离HPPC
5.从红酒中纯化HPPC
6.PHPPCs的纯度调查
7.PHPPCs的平均聚合度研究
采用苄基硫醇降解法计算PHPPCs中原花青素的平均聚合度（MDP）。
8.PHPPCs的碱性降解
9.PHPPCs的盐酸降解
10.盐酸降解后的样品衍生化程序
11.葡萄籽原花青素提取物的苄基硫醇降解
12.PHPPCs的苄基硫醇降解
13.NaOH降解的HPLC分析
4种PHPPCs的NaOH降解和水解产物的色谱图如图2（D-G）和表1所示。
表1. 通过HPLC/UPLC鉴定四种PHPPC中的化学降解化合物
14.盐酸降解的UPLC分析
15.苄基硫醇降解的HPLC分析
16.HPLC-ESI-FT-ICR-MS分析
表2. 通过HPLC-FT-ICR-MS鉴定四种PHPPC中的降解化合物
研究结果
1. PHPPC的纯度和MDP
如表3所示，4种PHPPC的纯度约在77.9%–85.0%之间，MDP在36.1和42.9之间。所得的PHPPC馏分含有高纯度的黄酮类化合物和聚合原花青素。
表3. 四种PHPPC的MDP和纯度
2. HPPC和PHPPC的HPLC分析
如图1（A）所示，在HPPC中发现了芍药素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷等单体花色苷，干扰了HPPCs的分析。用半制备型HPLC纯化后，除去单体或低聚酚类化合物。如图1（C）和（D）所示，在PHPPCs中未发现其他多酚杂质。结果表明，该方法得到的PHPPCs是合理的。
图1. HPPCs（A）和PHPPCs（B）在525 nm处的HPLC色谱图。HPLC在280 nm（C）和525 nm（D）处检查PHPPC的纯度
3. NaOH降解
碱性物质可能比酸性条件更有效地释放游离酚酸。NaOH被用作本研究的碱水解试剂。水解后采用HPLC-UV法检测出了9种酚酸（表1）。丁香酸、对香豆酸和肉桂酸是碱性水解发现的主要酚酸。4种PHPPC均检出原儿茶酸、丁香酸、对香豆酸和肉桂酸。没食子酸仅存在于CSP和SHP的PHPPCs中。CSP中未发现水杨酸。在CSC中未发现香草酸。结果证明，这些结合的酚酸可以在碱条件下水解，释放出所谓的可水解酚酸，这些可水解酚酸可能与黄烷-3-醇形成酯型共价键。橡木桶的陈酿是影响PHPPC结构和组成的重要因素之一。
4. 盐酸降解
从节省时间的角度来看，选择150℃ 1 h作为反应条件，结果如图2（H-L）和表1所示。在所有4种PHPPC中均检测到L-半胱氨酸和L-异亮氨酸。CSC和TRP的PHPPCs水解氨基酸单体更多。L-精氨酸仅存在于CSP和SHP中。这表明，L-半胱氨酸和L-异亮氨酸可能是PHPPCs的一部分。不同PHPPCs的结合氨基酸类型不同，可能与葡萄品种、葡萄起源，风土和葡萄栽培管理有关。
图2. 四种PHPPCs （CSP（D），CSC（E），TRP（F），SHP（G））在280 nm碱液中的水解色谱图。混合标准溶液中所有游离氨基酸（H）和4种PHPPCs（CSP（I），CSC（J），TRP（K），SHP（L））在254 nm的色谱图。葡萄籽原花青素提取物（M）和4种PHPPCs（CSP（N）、CSC（O）、TRP（P）、SHP（Q））葡萄籽原花青素提取物和4种PHPPCs在280 nm处硫解降解的水解色谱图。4种PHPPCs（CSP（R）、CSC（S）、TRP（T）、SHP（U））在525 nm的硫解降解过程中的水解色谱图
5. 苄基硫醇降解
选择苄基硫醇作为降解剂，将PHPPCs的硫解反应条件固定在90℃下20 min。
硫解解聚表明原花青素似乎是PHPPCs的骨架。如表1所示，(−)-表儿茶素、(+)-儿茶素、(−)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯和槲皮素是末端单位。此外，表没食子儿茶素、儿茶素（cis）、儿茶素（反式）、表儿茶素和表儿茶素-3-O-没食子酸酯是PHPPCs的延伸单元。还计算了聚合原花青素的mDP，由于单体花青素的存在，PHPPCs的实际mDP值可能高于仅基于黄烷醇延伸单元和末端单元的mDP。
6. HPLC-FT-ICR-MS分析苄基硫醇降解产物的花青素谱
在正离子模式下，采用HPLC-FT-ICR-MS检测花青素，结果见表2。通过加标实验鉴定峰37至41，标准品分别为飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛苷-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷。结果表明，锦葵素-3-O-葡萄糖苷（m/z：493.13254）是PHPPCs中的主要花青素，峰42为矢车菊素-3-O-(6′-乙酰基)-葡萄糖苷。此外，峰44、45、48、53等都得到了鉴定。峰43和峰46为未知化合物。
这项研究是化学水解后在PHPPC中首次鉴定出花青素衍生的色素（吡喃花青素和酰化花青素）。PHPPCs由这些花青素作为末端单元组成。未检测到与与延伸单元相对应的苄基硫醚相连的花青素单元。
7. 成分表征分析
基于上述结果，进一步提出了PHPPCs的假设结构组成表征，如图3。原花青素链似乎是PHPPCs最重要的结构骨架，(−)-表儿茶素、(+)-儿茶素和(−)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯单元被视为延伸和末端单元。(−)-表没食子儿茶素仅作为延伸单元存在。槲皮素是最典型的黄酮醇化合物，最初被发现是PHPPC的末端单元。检测到乙醛通过1,1-乙烯桥在A环上连接不同的原花青素，槲皮素也可能通过乙醛与原花青素连接。原花青素与槲皮素的相关性有待进一步研究。此外，碱性水解表明原花青素与各种酚酸酯化的可能性很大。氨基酸单体被认为是PHPPCs结构的潜在组成部分。花青素单体被证明是PHPPCs的末端单元，没有发现花青素-苄基硫醚等延伸单元。在PHPPCs降解液中检测锦葵素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基邻苯二酚、锦葵素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷丙酮酸加合物，推断吡喃花青素也是PHPPCs的末端单位。
图3. 红酒中纯化高分子质量聚合物多酚的假设化学结构
研究结论
首次获得PHPPCs，通过将PHPPCs分解成低分子量片段，采用三种化学降解方法推测其结构特征。通过苄基硫醇水解法在PHPPCs中检测出15种花青素、槲皮素和原花青素。花青素、槲皮素、儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素-3-O-没食子酸酯被证明是末端单元。原花青素由PHPPCs的延伸单元组成。9种结合酚酸可以与原花青素的羟基酯化并附着在PHPPCs上。通过盐酸降解在PHPPCs中发现了12个结合氨基酸。此外，还首次在PHPPCs中发现了飞燕草素-3-O-葡萄糖苷丙酮酸加合物、两种酰化花青素、羟基苯基吡喃花青素、原儿茶酸、香草酸、肉桂酸。
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