Plant Cell Rep：VaBAM3的过表达通过促进可溶性糖积累和活性氧清除来增强幼苗的耐寒性

VaBAM3的过表达通过促进可溶性糖积累和活性氧清除来增强幼苗的耐寒性

期刊：Plant Cell Reports（5.3）

发表日期：2024年

 

 

研究背景

 

在葡萄生产中，极端寒冷的条件会严重威胁植物的存活和果实质量。β-淀粉酶（BAM，EC：3.2.1.2）对淀粉含量的调节有助于植物的耐寒性。在这项研究中，我们从一种极度耐寒的葡萄Vitis amurensis中克隆了VaBAM3基因，并在番茄和拟南芥植物以及葡萄愈伤组织中过表达以进行功能表征。暴露于冷胁迫后，VaBAM3过表达番茄植株的叶片枯萎程度略低于野生型番茄植株，且自噬体积累显著。此外，VaBAM3过表达拟南芥植物比野生型拟南芥植物具有更高的耐冻性。在冷胁迫条件下，VaBAM3过表达植株的总淀粉酶、BAM、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著高于相应的野生型植株。此外，与野生型植物相比，这些品系中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量同样显着升高，而淀粉含量则降低。此外，我们在冷胁迫VaBAM3过表达植物中检测到高CBF和COR基因表达水平。与VaBAM3过表达葡萄愈伤组织相比，VaBAM3沉默的葡萄愈伤组织中的上述指标趋于相反方向变化。总的来说，我们的研究结果表明，VaBAM3的异源过表达通过促进可溶性糖的积累和清除过量的活性氧来增强植物的耐寒性。这些研究结果为耐寒葡萄的培育提供了理论依据，并支持了种质资源的创造。

 

研究结果

 

2.1 VaBAM3过表达番茄叶片中VaBAM3细胞定位、组织化学染色及抗氧化酶活性分析

我们构建了CaMV35S::VaBAM3-EGFP载体，并以CaMV35S::EGFP为对照，对烟叶进行瞬时转化，以确定VaBAM3在细胞中的定位(图1a)。我们观察到CaMV35S::EGFP在烟叶的所有细胞中表达，而CaMV35S::VaBAM3-EGFP主要在细胞质中表达(图1b)。我们利用农杆菌介导的方法转化番茄植株，获得了VaBAM3-过表达阳性的番茄植株(OE-3、OE-6和OE-9)。对VaBAM3过表达和野生型(WT)番茄植株进行48小时冷胁迫后的分析显示，WT植株的叶片枯萎下垂，而VaBAM3过表达的叶片萎蔫程度要轻得多(图1c)。我们发现，在非胁迫条件下，WT和VaBAM3过表达植物的叶片都没有出现自噬体染色，而在冷胁迫下，这两种植物的叶片都出现了自噬体染色。值得注意的是，与WT植株相比，过表达植株的自噬体数量显著增加(图1d)。DAB和NBT染色主要用于表征非生物胁迫下植物叶片中H2O2和O2−的积累情况。在非胁迫条件下，过表达VaBAM3的番茄株系与WT植株叶片的DAB染色无显著差异。然而，暴露于冷胁迫后，WT植物叶片的DAB染色显著，比过表达VaBAM3的植株叶片更强烈(图1e)。使用NBT获得类似的染色结果（图1 f）。随后，我们分析了抗氧化酶（POD、SOD和CAT）在冷胁迫和非胁迫WT和VaBAM3过表达番茄植株叶片中的相对电导率和活性。在相对电导率方面，虽然在正常条件下两种植物类型之间没有显著差异，但在暴露于冷胁迫后，过表达番茄显著低于WT植物的值（p < 0.05）（图1g）。在POD、SOD和CAT活性方面，在非胁迫条件下，WT和过表达番茄植株之间没有显著差异，而在冷胁迫之后，过表达番茄株系中3种酶的活性均显著升高（p < 0.01）（图1h-j）。这些结果表明，VaBAM3在番茄植株中的过表达增强了抗氧化酶的活性，促进了自噬体数量的增加，从而增强了植物的耐寒性。

 

 

2.2 冷胁迫对VaBAM3过表达番茄叶片淀粉酶活性、淀粉和可溶性糖含量的影响

在非胁迫和冷胁迫条件下，VaBAM3过表达株系中总淀粉酶和β-淀粉酶的活性显著高于WT植物（p < 0.01）（图2a，b）。此外，我们发现，在WT和VaBAM3过表达的植物中，与在非胁迫条件下测定的活性相比，这两种酶在冷暴露后的活性更高。在非胁迫和冷胁迫条件下，VaBAM3过表达系叶片淀粉含量均显著低于WT株<叶片淀粉含量（p < 0.05）。此外，在WT和VaBAM3过表达的植株中，冷胁迫后的淀粉含量低于非胁迫植株（图1）。2c）。在非胁迫条件下，WT和VaBAM3过表达番茄株系的蔗糖含量无显著差异。然而，在冷胁迫的响应下，我们检测到VaBAM3过表达系中的蔗糖水平明显高于WT植物（图2d）。此外，在冷胁迫和非胁迫条件下，VaBAM3过表达株系叶片中麦芽糖含量显著高于WT（图2e）。葡萄糖含量分析显示，在非胁迫条件下，WT和VaBAM3过表达植株之间没有显著差异，而冷胁迫VaBAM3过表达植株的葡萄糖水平显著高于冷胁迫WT植株（图2f）。此外，在WT和VaBAM3过表达的植物中，我们检测到暴露于冷胁迫后蔗糖、麦芽糖和葡萄糖的积累（图2d-f）。这些结果表明，VaBAM3过表达显着促进淀粉酶的水解活性，导致淀粉降解和可溶性糖的积累，这反过来又有助于维持细胞渗透潜力并确保在冷胁迫条件下持续供应富含能量的物质。

 

 

2.3 VaBAM3过表达番茄叶片中SlCBF和SlCOR表达水平响应冷胁迫的变化

在非胁迫条件下，VaBAM3过表达番茄株系OE-3和OE-9中冷响应转录因子SlCBF1的表达显著高于WT植株。在暴露于冷胁迫后，我们检测到WT植株和VaBAM3过表达番茄中SlCBF1表达的上调，尽管SlCBF1水平在后者的植株中仍然显着升高（p < 0.05）（图S3a）。在非胁迫条件下，WT和VaBAM3过表达植株的SlCBF2表达水平在冷胁迫下无显著差异，而在冷胁迫下，SlCBF2表达在VaBAM3过表达的番茄植株中显著增加并显著升高（图S3b）。此外，在非胁迫条件下，VaBAM3过表达番茄植株中SlCFB3的表达量显著高于WT植株（p < 0.05）。冷胁迫促进SlCFB3表达进一步显著增加（p < 0.01）（图S3c）。此外，我们确定在非胁迫条件下，另外两个冷调节基因SlCOR47-like和SlCOR413-like的表达水平在VaBAM3过表达植物中明显高于WT植物。冷胁迫显著增加（p < 0.01）显著提高了WT和VaBAM3过表达植物中SlCOR47样和SlCOR413样基因表达水平（图S3d，e）。因此，这些结果表明，番茄中VaBAM3的过表达促进了SlCBF和SlCOR表达的上调，这反过来又提高了这些植物的耐寒性。

 

2.4 冷胁迫对VaBAM3过表达拟南芥叶片存活、MDA含量及抗氧化酶活性的影响

对冷冻条件下拟南芥中VaBAM3过表达影响的分析表明，在冷冻处理之前，Col WT植株与VaBAM3过表达拟南芥株系（#3、#15和#20）之间没有显著差异。虽然我们在VaBAM3过表达的拟南芥中检测到部分存活，但很少有Col植物存活（图1）。3a）。随后在冷冻恢复实验中对Col植物和VaBAM3过表达株系的存活率进行了评估，结果表明VaBAM3过表达拟南芥株系的存活率显著高于Col植物（图3b）。我们继续研究了Col和VaBAM3过表达植物在4 °C下受到冷胁迫的响应，并分析了的积累H2O2和O2−在基于DAB和NBT组织化学染色的叶片中。DAB染色表明，在非胁迫条件下，Col叶片与VaBAM3过表达植株的染色无显著差异，而当植株暴露于冷胁迫时，Col叶片的染色明显比VaBAM3过表达系的染色更深（图3c）。拟南芥叶片NBT染色表明，在非胁迫条件下，Col植株染色叶片与VaBAM3过表达株系无显著差异（图3d）。随后，我们监测了在非胁迫条件下和暴露于4 °C冷胁迫48 h后叶片相对电导率的变化。结果表明，虽然在非胁迫条件下，WT Col和VaBAM3过表达植物之间没有显著差异，但在暴露于冷胁迫后，VaBAM3过表达系的值显著低于Col植物（图3e）。我们还发现，在非胁迫和冷胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达株系叶片中MDA含量的变化与观察到的REL变化相似（图3f）。随后，我们研究了冷胁迫对Col植物和VaBAM3过表达株系叶片中抗氧化酶POD、SOD和CAT活性的影响。关于POD活性，在非胁迫条件下，我们发现Col和VaBAM3过表达植物之间没有显着差异，而在暴露于冷胁迫后，我们观察到VaBAM3过表达系的活性水平显着提高（p < 0.01）（图3g）。SOD也检测到类似的活性模式（图3h）和CAT（图3i）。这些发现表明，拟南芥中VaBAM3的过表达促进了抗氧化酶的活性，从而增强了植物对冷胁迫条件的耐受性。

 

 

2.5 冷胁迫对VaBAM3过表达拟南芥叶片淀粉酶活性和可溶性糖含量的影响

在非胁迫条件下（p < 0.05）和暴露于冷胁迫（p < 0.01）下，VaBAM3过表达拟南芥株系叶片的总淀粉酶活性显著高于Col植物叶片（图4a）。关于β-淀粉酶活性，在非胁迫条件下，VaBAM3过表达系的淀粉酶活性也显著高于Col植物叶片中的-淀粉酶活性（p < 0.05），并且在冷胁迫下进一步显著增加（图4b）。淀粉含量分析显示，在非胁迫条件下，VaBAM3过表达系的水平显著降低（p < 0.05）。在暴露于冷胁迫下，我们检测到Col和VaBAM3过表达植物的淀粉含量降低，转基因植物显示出统计学上的显着降低（p < 0.05）（图4c）。在非胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达拟南芥植株在蔗糖含量方面无显著差异。在冷胁迫下，两种植物类型的蔗糖含量都有所增加（图4d）。在非胁迫条件下，VaBAM3过表达株系的麦芽糖含量显著高于Col麦芽糖含量（p 0.05）。暴露于冷胁迫后，Col和VaBAM3过表达的植株的麦芽糖含量均有所增加，但后者的麦芽糖水平仍然显着升高（p < 0.05）（图4e）。在非胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达植物的葡萄糖含量没有显著差异，而在冷胁迫下，VaBAM3过表达株系的葡萄糖水平显著升高（p < 0.05）（图4f）。总之，这些结果表明，在受冷胁迫的拟南芥植物中，VaBAM3过表达显著增强了淀粉酶活性并促进了可溶性糖的积累。

 

 

2.6 VaBAM3过表达拟南芥叶片中AtCBF和AtCOR表达响应冷胁迫的变化

接下来，我们量化了拟南芥叶片中转录因子AtCBF和AtCOR的表达水平（图S4）。在非胁迫条件下，VaBAM3过表达系的AtCBF1表达显著高于Col植株（图S4a），并且在暴露于冷胁迫后进一步显着增加（p < 0.01）。在非胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达植物的AtCBF2和AtCBF3表达水平差异无统计学意义。然而，在暴露于冷胁迫时，这些基因在VaBAM3过表达系中的表达水平显著高于Col植物（图S4b，c）。在非胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达植物之间冷调控基因AtCOR47的表达水平无显著差异，而暴露于冷胁迫后，该基因在VaBAM3过表达植物中的表达显著升高（p < 0.05）（图S4d）。在非胁迫条件下，Col和VaBAM3过表达植物之间另一个冷调节基因AtCOR15A的表达没有显著差异。在冷胁迫下，该基因在Col植株和VaBAM3过表达系中均显著上调（p < 0.01）（图S4e）。在非胁迫条件下，VaBAM3过表达株系中冷响应基因AtRD29A的表达显著降低（p < 0.05），但在冷胁迫条件下，转基因植物的表达显著上调（p < 0.05）（图S4f）。这些结果表明，低温暴露促进了VaBAM3过表达拟南芥系中AtCBF和AtCOR基因表达的显著上调，从而增强了这些植物的耐寒性。

 

2.7 VaBAM3-OE和VaBAM3敲除突变体（Vabam3KO）葡萄愈伤组织的鉴定及其对冷胁迫的反应

将VaBAM3与编码GFP的基因融合，用于葡萄愈伤组织的后续转化，并根据其对潮霉素的抗性选择阳性转基因葡萄愈伤组织（图5a）。在立体荧光显微镜下，检查新产生的愈伤组织是否发出绿色荧光（图5b，c）。在倒置荧光显微镜下观察来自阳性愈伤组织的细胞，并显示发出绿色荧光（图5D-F）。使用hyg基因的引物进一步表征转化的葡萄愈伤组织，该基因鉴定出10个阳性愈伤组织肿块（命名为VaBAM3-OE）（图5g）。这些结果表明，VaBAM3在葡萄愈伤组织中已成功过表达。此外，我们构建了一个CRISPR/Cas9重组载体来编辑VaBAM3，从而沉默VaBAM3，其中编辑的靶序列是GCTGCCGAAGGAATATTCCA，PAM序列是GGG（图5h）。随后，我们使用含有编辑过的VaBAM3的重组载体，使用基于农杆菌的方法转化葡萄愈伤组织。转化后测序显示，VaBAM3基因PAM序列之前的TT和ATT碱基已被编辑。因此，我们验证了VaBAM3在愈伤组织中被成功编辑和沉默，我们最终获得了两个阳性愈伤组织细胞团（Cas9-1和Cas9-7，命名为Vabam3KO）（图5i）。随后对WT、VaBAM3-OE和Vabam3KO愈伤组织进行冷胁迫10 d。此后的观察表明，虽然在VaBAM3-OE愈伤组织周围形成了新的愈伤组织物质，但WT和Vabam3KO愈伤组织已经变褐，没有形成新的愈伤组织（图1）。5J）。我们继续分析了POD、SOD和CAT在非胁迫和冷胁迫条件下WT、VaBAM3-OE 和 Vabam3KO愈伤组织的活性。在胁迫条件下，WT、VaBAM3-OE和Vabam3KO愈伤组织的POD活性没有显著差异，而在暴露于冷胁迫后，我们发现VaBAM3-OE愈伤组织的POD活性显著高于WT愈伤组织（图5k）。同样，我们发现在非胁迫条件下，WT、VaBAM3-OE和Vabam3KO愈伤组织之间的SOD活性没有显著差异。然而，在冷胁迫反应下，与WT愈伤组织相比，VaBAM3-OE愈伤组织中的SOD活性显著升高（p < 0.05），而Vabam3KO愈伤组织中的SOD活性显著降低（图5l）。CAT活性的变化与POD和SOD的观察结果一致（图5m）。这些结果表明，在冷胁迫条件下，VaBAM3过表达的葡萄愈伤组织比WT或Vabam3KO愈伤组织具有更高的活性氧清除能力。

 

 

2.8 冷胁迫对葡萄愈伤组织淀粉酶活性和可溶性糖含量的影响

在非胁迫条件下，VaBAM3-OE愈伤组织的总淀粉酶活性显著升高（p < 0.05），Vabam3KO愈伤组织的总淀粉酶活性显著降低（p < 0.05）。暴露于冷胁迫后，这些差异持续存在：VaBAM3-OE愈伤组织中的淀粉酶活性显著高于WT愈伤组织中的淀粉酶活性（p < 0.05），而WT愈伤组织又显著高于Vabam3KO愈伤组织中的活性（p < 0.01）（图6a）。VaBAM3-OE、Vabam3KO和WT植物愈伤组织在非胁迫条件下和暴露于冷胁迫时β-淀粉酶活性的差异与观察到的总淀粉酶活性相同（图6b）。在非胁迫条件下，与WT愈伤组织相比，Vabam3KO愈伤组织淀粉酶含量已显著增加（p < 0.05），但VaBAM3-OE愈伤组织中淀粉酶含量显著降低（p < 0.05）。暴露于冷胁迫后，我们检测到Vabam3KO愈伤组织中淀粉酶的显着积累（p < 0.01），VaBAM3-OE愈伤组织中的淀粉酶显着减少（p < 0.01）（图6c）。

在可溶性糖含量方面，在非胁迫条件下，VaBAM3-OE愈伤组织中蔗糖的积累显著（p < 0.01），而WT和Vabam3KO愈伤组织之间的蔗糖含量差异不显著。在冷胁迫后，我们检测到VaBAM3-OE愈伤组织中蔗糖的显着积累（p < 0.01），但Vabam3KO愈伤组织显着减少（p < 0.01）（图6d）。在非胁迫条件下，我们观察到VaBAM3-OE愈伤组织中的麦芽糖含量显著增加（p << 0.01），与WT愈伤组织中的麦芽糖含量相比，Vabam3KO愈伤组织中的麦芽糖含量显着减少（p 0.05）。暴露于冷胁迫后，在VaBAM3-OE愈伤组织中检测到麦芽糖的显着积累（p < 0.01），而在Vabam3KO愈伤组织中检测到麦芽糖水平显着降低（p < 0.05）（图6e）。葡萄糖含量的特征是，在非胁迫条件下和冷胁迫下，VaBAM3-OE愈伤组织中的葡萄糖含量显著（p < 0.05）积累，而Vabam3KO愈伤组织中的葡萄糖含量显着降低（p < 0.05）（图6f）。这些结果表明，VaBAM3在葡萄愈伤组织中的过表达促进了淀粉酶介导的淀粉水解，从而增加了低温条件下细胞中可溶性糖的含量，从而最终增强了耐寒性。

 

2.9 冷胁迫对转基因葡萄愈伤组织VvCBF和VvCOR表达的影响

接下来，我们分析了VvCBF和VvCOR基因在VaBAM3-OE、Vabam3KO和WT愈伤组织中的表达模式。在非胁迫条件下，VvCBF3的表达在不同类型愈伤组织中无显著差异。相反，在冷胁迫后，该基因的特征是与WT愈伤组织相比，VaBAM3-OE愈伤组织中的表达显著高，Vabam3KO愈伤组织中的表达显著降低（p < 0.05）（图7a）。在非胁迫条件下，VaBAM3-OE和Vabam3KO愈伤组织中VvCBF4的表达水平显著低于WT愈伤组织（p < 0.05）。相比之下，在冷胁迫条件下，VaBAM3-OE愈伤组织中的VvCBF4表达水平显著升高（p < 0.05），而Vabam3KO愈伤组织中的表达水平显著低于WT愈伤组织（图7b）。VvCBF6的表达模式与VvCBF4的表达模式一致，在冷胁迫下，VaBAM3-OE愈伤组织中的表达显著高（p < 0.05），Vabam3KO愈伤组织的表达显著降低（图7b）。在非胁迫条件下，VvCOR47在VaBAM3-OE、Vabam3KO和WT愈伤组织中的表达水平相似，而在冷胁迫后，VvCOR47表达显著（p < 0.01）增加了VaBAM3-OE愈伤组织，与WT愈伤组织相比，Vabam3KO愈伤组织几乎不存在（图7d）。此外，与WT愈伤组织中的表达相比，VvCOR413在非胁迫条件下在VaBAM3-OE愈伤组织中的表达水平显著升高（p < 0.05），而在冷胁迫下，VvCOR413在VaBAM3-OE愈伤组织中的表达显著升高（p < 0.05），在Vabam3KO愈伤组织中的表达水平显著降低（p < 0.05）。这些结果表明，在寒冷条件下，葡萄愈伤组织中VaBAM3过表达上调了VvCBF和VvCOR基因的表达，从而有助于增加愈伤组织的耐寒性。

 

 

研究结论

 

综上所述，本研究结果表明，β淀粉酶基因VaBAM3的过表达促进了冷胁迫下葡萄愈伤组织的淀粉降解，导致可溶性糖含量增加，ROS清除增强，冷响应基因（CBFs和CORs）表达上调，从而有助于增强耐寒性。相反，愈伤组织中VaBAM3的基于编辑的沉默降低了暴露于冷应激时淀粉降解的程度，从而导致可溶性糖含量降低，从而降低了愈伤组织的耐寒性（图8）。本研究对VaBAM3效应的表征为耐寒葡萄种质资源的开发和培育提供了理论依据。