Plant Science：一个新的葡萄WRKY转录因子VvWRKY70，通过协同调控生理与分子应答提高植株耐旱性

一个新的葡萄WRKY转录因子VvWRKY70，通过协同调控生理与分子应答提高植株耐旱性

期刊：Plant Science（4.2）

发表日期：2026年1月

 

 

研究摘要

 

干旱是制约葡萄产量的关键因素，解析植物应对环境胁迫的应答机制具有重要研究价值。WRKY转录因子广泛参与植物生长发育与胁迫应答过程，但在葡萄（Vitis vinifera L.）中，完成功能解析的WRKY基因数量仍然较少。本研究从葡萄中克隆获得VvWRKY70基因，利用转基因拟南芥和葡萄幼苗完成该基因的功能鉴定。VvWRKY70蛋白定位于细胞核，具备Wbox顺式作用元件结合活性。干旱胁迫能够快速诱导VvWRKY70基因表达；在拟南芥中异源过表达VvWRKY70可显著提高植株耐旱性，种子萌发效率、幼苗生长状态与植株存活能力均得到改善。过表达VvWRKY70能够缩小气孔开度，促进脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质积累。同时，过表达株系的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性上升，花青素积累量增加；水分胁迫条件下，植株体内过氧化氢、丙二醛含量显著下降。在葡萄植株内瞬时过表达VvWRKY70后，ABA依赖通路干旱标记基因（VvRD22）、非ABA依赖通路干旱标记基因（VvRD29A、VvDREB2A、VvERD14），以及抗逆防御基因（VvCHS、VvF3’H、VvDFR、VvPOD4、VvP5CS）表达上调。上述结果表明，VvWRKY70可直接调控上述基因转录，进而调控对应的生理代谢过程。综合结果证实，VvWRKY70是葡萄抗旱遗传改良极具潜力的候选基因。

 

研究背景

 

农作物持续遭受各类生物、非生物胁迫，干旱是破坏性极强的环境因子，往往造成农作物严重减产与品质下降。植物属于固着生物，进化形成精密的防御调控体系应对逆境刺激，包括气孔运动调控、抗氧化系统激活、渗透调节，以及生理代谢通路协同重编程。转录调控是植物应对胁迫最早启动的适应性机制之一，通过调控基因表达提升耐逆性，帮助植物适应不良环境。WRKY、MYB、NAC、AP2/ERF等转录因子家族，结合RD29A、DREB2A、RD22等干旱应答基因，共同构成植物耐旱调控网络的核心组分。

WRKY为植物特有转录因子，广泛存在于各类植物，在干旱、盐胁迫、低温等非生物胁迫应答中发挥关键调控作用。WRKY家族是植物体内规模较大的转录调控家族，依据WRKY结构域数量与锌指基序结构，划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个亚家族。WRKY转录因子识别靶基因启动子区Wbox顺式作用元件（保守序列：TTGACC/T），以此调控下游基因转录；该家族蛋白既可以结合自身启动子实现自我调控，也能够结合家族其他成员的启动子实现互作调控。WRKY蛋白活性受脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素，蛋白激酶以及活性氧等上游信号组分精细调控，形成复杂信号网络。

大量研究证实WRKY转录因子是植物干旱应答的关键调控分子。部分WRKY基因异源过表达可提高拟南芥耐旱能力，该表型与ABA信号通路激活、植株抗氧化能力提升相关；但也存在部分WRKY基因作为负调控因子，抑制转基因拟南芥对干旱、渗透胁迫的耐受性。这种功能分化，体现WRKY介导的干旱适应调控网络具有复杂性。

葡萄是全球重要经济果树，在农业生产与区域经济发展中占据重要地位，而水资源短缺会显著限制葡萄的产量与品质。目前生物信息学分析已在葡萄基因组鉴定出59个WRKY基因，绝大多数基因可响应逆境胁迫。受限于葡萄遗传转化技术难度，科研人员普遍采用异源表达体系解析葡萄基因功能。现有研究已经完成十余个VvWRKY基因的功能验证，其中5个基因参与渗透、干旱、盐胁迫应答。

VvWRKY70（LOC100255013）尚未开展功能解析。该基因受干旱诱导，启动子含有干旱、ABA及多种胁迫应答顺式元件；编码蛋白与多个已证实参与耐旱调控的WRKY70同源蛋白序列相似度高，提示VvWRKY70在葡萄干旱胁迫应答中具备重要作用。

本研究从‘汉堡麝香’葡萄中克隆WRKY家族新基因VvWRKY70，在拟南芥、葡萄材料中解析该基因的耐旱相关功能。结果表明VvWRKY70属于干旱胁迫应答正调控因子；该基因通过协同调控花青素合成积累、提高抗氧化酶活性、促进脯氨酸富集，清除活性氧、维持细胞水分，从而增强植株干旱抵御能力。本研究解析VvWRKY70提高植株耐旱性的潜在调控机制，为耐旱作物育种提供理论依据。

 

材料与方法

 

2.1植物材料与培养条件

试验葡萄品种为‘霞多丽’。组培苗制备：选取带单芽的葡萄茎段外植体，70 %乙醇表面消毒30 s，3 %次氯酸钠溶液灭菌10 min，无菌蒸馏水冲洗5次。外植体接种于1/2 MS固体培养基（pH 5.8），培养基含蔗糖30 g・L⁻¹、6BA 1.0 mg・L⁻¹、IBA 0.2 mg・L⁻¹、激动素0.5 mg・L⁻¹，培养2025 d。切取新生带单芽茎段，转接MS固体培养基（pH 5.8），添加6BA 0.4 mg・L⁻¹、IBA 0.4 mg・L⁻¹、蔗糖30 g・L⁻¹、活性炭0.5 g・L⁻¹，培养3050 d。培养条件：温度25 ± 2 ℃，光合光子通量密度140 μmol・m⁻²・s⁻¹，光周期16 h光照/8 h黑暗。

土壤栽培葡萄炼苗：将健壮组培苗移栽营养土，喷施无菌水，覆膜保持高湿度，逐步揭除薄膜完成驯化。

本试验全部拟南芥材料（野生型、转基因株系）遗传背景为Columbia0（Col0）。种子播种于高营养基质；培养环境：相对湿度6070 %，温度23 ± 2 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照强度140 μmol・m⁻²・s⁻¹，连续培养4周。

拟南芥种子灭菌：6 %次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗5次；播种于添加1 %蔗糖、0.8 %琼脂的1/2 MS培养基（pH 5.8）。4 ℃春化3 d，转移至培养箱，23 ℃恒温，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照强度140 μmol・m⁻²・s⁻¹。

 

2.2 VvWRKY70生物信息学分析

 

2.3 VvWRKY70蛋白转录激活活性检测

 

2.4过表达VvWRKY70转基因拟南芥株系创制

 

2.5水分胁迫处理

 

2.6生理生化指标测定

 

2.7气孔开度测定

 

2.8农杆菌介导葡萄幼苗瞬时表达

 

2.9 RNA提取与qRTPCR

 

2.10数据分析

 

研究结果

 

3.1 VvWRKY70基因生物信息学分析

生物信息学结果表明：VvWRKY70定位于8号染色体，编码322个氨基酸，预测分子量36.57 kDa。蛋白序列含有WRKYGQK保守基序与C2HC型锌指结构，和MfWRKY70、PlWRKY70同源性较高，归属于WRKY家族Ⅲ亚家族。VvWRKY70启动子包含水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸等激素应答元件，同时存在干旱MYB结合元件MBS、厌氧诱导元件ARE、低温应答元件LTR，说明该基因可能参与生物、非生物胁迫应答。

 

 

3.2 VvWRKY70蛋白亚细胞定位与转录激活活性

酵母单杂交结果显示，共转化pGADT7ADVvWRKY70与pAbAiWbox的酵母，可在含750 ng/mL金担子素A的筛选培养基正常生长；其余对照组酵母无法存活。证明VvWRKY70能够特异性识别Wbox顺式元件，激活报告基因转录。

将VvWRKY70编码序列与GFP报告基因框内融合，转化拟南芥，筛选得到3个稳定过表达株系L1、L2、L3。激光共聚焦观察转基因拟南芥根部，绿色荧光与DAPI细胞核染色信号重合，证实VvWRKY70定位于细胞核，属于转录因子。

 

 

3.3 VvWRKY70参与干旱胁迫应答

干旱处理葡萄叶片1 h后，VvWRKY70表达量显著上调，并持续维持高表达。转基因拟南芥遭受干旱胁迫时，VvWRKY70的mRNA水平同样升高。说明VvWRKY70参与植物干旱胁迫应答过程。

 

 

3.4水分亏缺条件下转基因拟南芥种子萌发与幼苗生长分析

正常1/2 MS培养基上，转基因株系与野生型拟南芥种子萌发、幼苗生长状态无明显差别。添加150 mM、300 mM甘露醇模拟渗透胁迫时，转基因株系种子萌发率、子叶绿化率显著高于野生型；幼苗根长测定结果也表现出相同趋势。结果说明异源表达VvWRKY70，可以提高拟南芥种子萌发和幼苗早期发育阶段对水分亏缺的耐受能力。

 

 

3.5拟南芥过表达VvWRKY70增强干旱胁迫耐受性

干旱胁迫处理后，拟南芥叶片发生卷曲萎蔫；干旱第8 d、第10 d，野生型植株萎蔫程度明显重于转基因株系。叶片相对含水量测定结果与表型保持一致，转基因株系相对含水量显著高于野生型。干旱胁迫8 d后复水2 d，过表达株系植株存活率显著高于野生型。转基因植株离体叶片失水速率更低，气孔开度更小。表明VvWRKY70可以调控气孔运动，提升植株保水能力，增强耐旱性。

 

 

3.6 VvWRKY70调控干旱胁迫下的氧化还原平衡

干旱胁迫会诱导植物细胞大量产生活性氧，打破活性氧生成清除平衡，造成氧化损伤。干旱条件下，SOD、POD、CAT抗氧化酶活性整体上升；转基因株系酶活性提升幅度高于野生型。编码上述抗氧化酶的基因AtCSD1、AtCSD2、AtPOD、AtCAT3在转基因材料中表达上调。同时，作为氧化损伤标志物的过氧化氢、丙二醛含量，转基因拟南芥显著低于野生型。说明异源过表达VvWRKY70能够提升植株抗氧化能力，维持水分亏缺条件下的氧化还原稳态。

 

 

3.7 VvWRKY70参与干旱胁迫下的次生代谢调控

花青素属于重要次生代谢物质，具备清除自由基的生理功能。水分亏缺能够诱导花青素积累；干旱条件下，VvWRKY70过表达株系花青素积累量高于野生型。花青素合成关键基因AtCHS、AtF3H、AtCHI、AtDFR、AtANS在干旱处理后表达上调，且转基因株系上调幅度更大。说明VvWRKY70通过激活花青素合成相关基因，促进干旱环境下花青素积累。

 

3.8 VvWRKY70参与干旱胁迫下的渗透调节

渗透调节是植物适应干旱胁迫的重要生理机制。干旱胁迫诱导脯氨酸、可溶性糖两类渗透调节物质积累；转基因拟南芥中两种物质积累水平显著高于野生型对照。脯氨酸合成通路关键基因AtP5CS1、AtP5CS2、AtP5CR仅在干旱处理后的转基因植株中显著上调，正常供水条件下各组无明显差异。结果表明，过表达VvWRKY70的植株，可通过调控渗透溶质合成积累，获得更强渗透调节能力。

 

 

3.9葡萄叶片瞬时过表达VvWRKY70激活防御应答通路

农杆菌介导瞬时表达结果显示，浸润处理第3 d、第5 d，OEVvWRKY70组葡萄叶片VvWRKY70表达量显著高于野生型、空载体对照组，瞬时过表达成功。

对比对照组，瞬时过表达VvWRKY70的葡萄叶片中，ABA依赖型干旱标记基因VvRD22，非ABA依赖型干旱标记基因VvDREB2A、VvRD29A、VvERD14表达显著升高；花青素合成基因、抗氧化基因、脯氨酸合成基因同样上调。证明VvWRKY70调控下游靶基因转录，参与调控植物耐旱相关核心生理通路。

 

 

讨论

 

植物进化形成多层次的逆境适应机制；WRKY基因家族是植物胁迫应答中转录、代谢重编程的核心调控因子。已有大量研究在多种作物中鉴定出参与抗逆调控的WRKY转录因子。本研究证实VvWRKY70可以通过调控气孔运动、氧化还原平衡、渗透调节、次生代谢多重途径协同提高植株耐旱能力，为解析葡萄干旱适应机制提供新认识。

WRKY转录因子发挥功能，需要感知上游信号，靶向调控下游通路。本研究发现，葡萄中瞬时过表达VvWRKY70，会诱导干旱应答标记基因与抗逆防御基因同步上调，说明VvWRKY70依靠多层级复杂网络实现生物学功能。

植物干旱应答分为ABA依赖通路与非ABA依赖通路。本试验中，VvWRKY70过表达可同时激活两类通路对应的标记基因，与已发表研究结果吻合，提示VvWRKY70协同调控两套信号通路介导植物耐旱。

叶片相对含水量是评价植物干旱适应性的核心生理指标。VvWRKY70过表达拟南芥在干旱下可以维持更高叶片相对含水量。一方面植株气孔开度降低，减少蒸腾失水；另一方面根系生长得到促进，提升水分吸收能力。这种双向调控水分收支的模式，在其他WRKY基因的研究中同样存在。

干旱胁迫会造成活性氧过量积累，产生脂质过氧化损伤。VvWRKY70过表达株系抗氧化酶活性升高，过氧化氢、丙二醛含量下降，说明VvWRKY70通过上调抗氧化相关基因，缓解干旱带来的氧化伤害。

渗透调节对于干旱下维持细胞膨压十分关键。VvWRKY70能够上调脯氨酸合成关键基因，促进脯氨酸与可溶性糖积累。脯氨酸既作为渗透保护物质，又可以保护抗氧化酶，双重作用共同提升植株抗逆水平。

花青素是植物重要次生代谢物，积累花青素是植物缓解干旱损伤的保守适应策略。本研究中VvWRKY70上调花青素合成通路基因，促进花青素积累。花青素除清除活性氧外，还可发挥渗透保护作用，共同提升植株耐旱性能。

蛋白亚细胞定位、酵母单杂交试验证明VvWRKY70定位于细胞核，具备Wbox元件的转录激活活性，属于WRKY转录因子。基因表达结果显示，VvWRKY70表达量与抗氧化、脯氨酸合成、花青素合成通路基因转录水平正相关。拟南芥与葡萄中多条受VvWRKY70调控的靶基因启动子区均存在Wbox顺式元件。据此推测VvWRKY70对功能基因存在直接或者间接调控，进而介导干旱耐受。后续可开展ChIPseq、BiFC试验，鉴定该转录因子直接靶基因，完善调控通路解析。

本研究结果还观察到，受CaMV 35S组成型启动子驱动的VvWRKY70，在干旱条件下转录本进一步积累。已有文献证实35S启动子可被干旱等逆境诱导，该启动子序列本身含有多种胁迫应答顺式元件，这可以解释该现象。同时VvWRKY70自身启动子含有ABA、厌氧应答元件，干旱、外源ABA均可诱导该基因转录，证明VvWRKY70的转录受ABA、ROS信号通路协同调控。

 

 

结论

 

综上所述，本研究鉴定得到受干旱诱导的葡萄WRKY基因VvWRKY70。拟南芥异源过表达该基因，能够提高叶片相对含水量、增强抗氧化酶活性，减轻干旱损伤。其调控机制为转录激活花青素合成、抗氧化酶、脯氨酸合成相关基因。葡萄瞬时转化试验进一步验证该基因的抗逆功能。多重生理过程协同，提升植株活性氧清除与保水能力，帮助植物抵御干旱胁迫。VvWRKY70是干旱信号网络重要整合因子，在葡萄及其他作物耐旱遗传改良中具备良好应用前景。