IF:9.5│石大：生理学、转录组学和miRNA组学分析验证vvi-miR395a-VvExpA10模块在葡萄耐盐碱胁迫中的作用

导读

土壤盐碱化制约了农业生产。鉴定盐碱胁迫背后的关键调控基因和分子机制对于培育耐受性作物至关重要。本研究使用耐盐碱性不同的葡萄品种‘和田红’（HTR）和‘甬优1号’（YY），对其进行了生理学、microRNA组学和转录组学分析。HTR积累了更多的渗透调节物质，并保持相对完整的叶绿体结构，表现出优于YY的抗逆性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，盐碱处理并未改变叶片细胞壁官能团的基本组成，但影响了其相对含量。鉴定出26个对盐碱胁迫显著响应的miRNA。在盐碱胁迫下，vvi-miR395a的表达在HTR中显著下调，而在YY中下调幅度较小。RLM-5′RACE和GUS组织化学染色表明，vvi-miR395a直接靶向VvExpA10。过表达vvi-miR395a抑制了VvExpA10的表达，并降低了葡萄愈伤组织和根中的果胶和纤维素含量，但增加了丙二醛含量。在转基因愈伤组织中同时过表达VvExpA10-OE和STTM395a显著提高了盐碱耐受性。这些发现表明，抑制vvi-miR395a会削弱其对VvExpA10的靶向切割，从而提高细胞壁组分的水平，并显著增强葡萄对盐碱胁迫的耐受性。本研究验证了vvi-miR395a-VvExpA10模块在葡萄响应盐碱胁迫中的调控作用，为通过遗传改良提高葡萄对盐碱胁迫的耐受性提供了潜在靶点。

论文ID

 

原名：Integrated miRNAome and transcriptome analysis validates the role of the vvi-miR395a-VvExpA10 module in saline-alkali stress tolerance of grape

译名：整合miRNA组和转录组分析验证了vvi-miR395a-VvExpA10模块在葡萄耐盐碱胁迫中的作用

期刊：Horticulture Research

IF：9.5

发表时间：2026.8

通讯作者：孙军利、赵宝龙，刘继红

通讯作者单位：石河子大学农学院 

DOI号: 10.1093/hr/uhag361

实验设计

 

结果

 

1   葡萄在盐碱胁迫下表型、叶绿体超微结构及生理/生化指标变化

HTR和YY对盐碱胁迫表现出明显的表型响应差异。YY出现叶片黄化、干枯和顶芽萎蔫，而HTR仅基部叶片黄化，顶芽受影响较小，表明其耐盐碱能力更强（图1A）。在盐碱胁迫下，YY的株高、茎粗和相对含水量均显著低于HTR（图1B-D），而HTR的相对电导率显著低于YY（图1E）。在盐碱胁迫下抗氧化酶活性显著升高，其中HTR的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性均显著高于YY（图S1A-C）。两个品种的H₂O₂、O₂^-和丙二醛（MDA）水平在盐碱胁迫下均显著升高，且YY中的含量显著高于HTR（图S1D-F）。相反，HTR叶片中的脯氨酸（PRO）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量均显著高于YY（图S1G-I）。与对照（CT）相比，两个品种的叶绿素含量均显著下降，其中YY降幅最大。盐碱胁迫抑制了光系统II，显著降低了YY叶片中的Fv/Fm值（图S1J-L）。在盐碱胁迫下，两个葡萄品种的根系生长均受到抑制。正常条件下，两个品种的根系生长良好，白根丰富，无黑根。HTR的主根伸长更快，而YY的侧根分布更广。盐碱处理后，YY的侧根出现褐变，两个品种的根长、根表面积、根尖数量和根系活力均显著降低。值得注意的是，HTR所有指标的下降幅度均显著小于YY；具体而言，HTR的根系活力仅下降10.45%，远低于YY的45.61%（图S2），表明HTR比YY具有更强的盐碱耐受性。

研究者利用FTIR分析盐碱胁迫对细胞壁组分的影响。HTR品种通过影响细胞壁官能团来缓解盐碱胁迫（图1F）。不同品种和处理下，叶片中FTIR官能团峰的位置保持不变，但峰强度略有变化。因此，盐碱胁迫影响了相对丰度，但没有改变基本官能团组成。与CT相比，盐碱胁迫在3405、2925、1729、1384和1055 cm^-1处诱导的吸收峰更高，分别对应于蛋白质和碳水化合物中的O-H和N-H伸缩振动；脂质和蛋白质中反式-CH₂伸缩振动（存在于所有细胞壁多糖的糖环上，包括纤维素、半纤维素和果胶）；细胞壁果胶成分中脂质化合物的C=O伸缩振动；以及多糖中的C-H弯曲振动与C-C和C-O伸缩振动。CT组的吸收峰低于盐碱胁迫组，HTR的吸收峰高于YY（表S1）。这表明盐碱胁迫下HTR细胞壁组分积累量显著高于YY。为了进一步验证这一发现，研究者测定了葡萄叶片中的细胞壁组分含量。与CT相比，盐碱胁迫下HTR葡萄叶片中木质素、纤维素、半纤维素和果胶的增加量分别为18.59%、36.24%、58.50%和28.99%；而YY葡萄叶片中的增加量分别为17.40%、27.16%、35.78%和10.10%，表明细胞壁组分含量增加（图1G-J）。

叶绿体超微结构观察结果表明，盐碱胁迫诱导HTR和YY中发生了不同程度的形态变化。与CT相比，YY叶片细胞收缩，叶绿体表现出明显的形态异常，包括叶绿体膜破裂、基粒和基质片层弥散、基质片层间隙增大以及淀粉粒膨大，导致淀粉大量积累。叶绿体结构逐渐解体，表明盐碱胁迫下YY的叶绿体受损严重。HTR的叶绿体受损程度低于YY。叶绿体膜保持完整，基质片层呈堆叠排列，叶绿体结构相对完整。这表明HTR在盐碱胁迫下能保持相对完整的叶绿体结构（图1K-N）。

图1.盐碱（SA）胁迫对耐盐碱葡萄品种HTR和盐碱敏感品种YY的表型、叶绿体超微结构、细胞壁组分及生理指标的影响。（A）在CT和SA处理24天后HTR和YY植株的表型。标尺=15 cm。（B）株高。（C）茎粗。（D）相对含水量。（E）相对电导率。（F）在CT和SA胁迫下HTR和YY叶片的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。（G）果胶含量。（H）纤维素含量。（I）半纤维素含量。（J）木质素含量。（K）正常条件下HTR叶绿体的超微结构和放大视图。（L）盐碱胁迫下HTR叶绿体的超微结构和放大视图。（M）正常条件下YY叶绿体的超微结构和放大视图。（N）盐碱胁迫下YY叶绿体的超微结构和放大视图。数据以平均值±标准差表示（n ≥ 3）。采用单因素方差分析结合Tukey检验进行多重比较。不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。HTR：‘和田红’；YY：‘甬优1号’；CT：对照；SA：盐碱胁迫；UE：上表皮；LE：下表皮；PT：栅栏组织；ST：海绵组织；Ch：叶绿体；V：液泡；CW：细胞壁；GL：基粒片层；SL：基质片层；SG：淀粉粒。

2   转录组分析及差异表达基因（DEGs）的功能注释

为了在分子水平上阐明盐碱胁迫的影响，研究者采用PE150模式对两个葡萄品种进行转录组测序。通过测定叶片Fv/Fm和H₂O₂含量确定了转录组测序的最佳采样时间（图S3）。共获得19711100至22681155条干净读取序列，GC含量高于46.11%，Q30碱基百分比为95.79%。比对到参考基因组Vitis_vinifera.GCA_030704535.1的高质量读取比对效率为94.33%-95.62%，表明RNA测序（RNA-seq）数据质量高（表S2）。主成分分析显示，各处理组内的重复样本之间高度相似（图2A）。转录组分析结果显示，盐碱胁迫后在HTR中鉴定出3101个DEGs，在YY中鉴定出2541个DEGs（图2B），其中共有939个DEGs（图2C）。基因本体论（GO）富集分析揭示了分子功能、细胞组分和生物学过程层面的变化。在前20个富集的GO条目中，HTR富集了7个分子功能条目，而YY富集了6个。生物过程富集分析鉴定出HTR富集了10个，YY富集了11个（表S3）。不同葡萄品种表现出不同的胁迫响应。在盐碱胁迫下，HTR通过转录因子调控，激活细胞壁合成与重塑、离子稳态和膜稳定性等关键过程来抵抗胁迫损伤（图S4）。相比之下，YY通过激活细胞壁代谢、膜结构稳定性和蛋白激酶信号通路来实现细胞结构和生理功能的适应性调整，以减轻胁迫伤害（图S5）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，盐碱胁迫下戊糖-葡萄糖醛酸相互转化（ko00040）、植物激素信号转导（ko04075）、类黄酮生物合成（ko00941）和半乳糖代谢（ko00052）显著富集（图S6和表S4）。

研究者使用加权共表达网络分析（WGCNA），分析了盐碱胁迫耐受品种中的DEGs与可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（SS）、PRO和SOD活性等生理指标之间的相关性（图2）。总体而言，1926个基因被分配到7个模块，其中浅黄色模块包含23个基因（图2F）。模块与生理指标的相关性分析表明，棕色模块与SP含量、SS含量、PRO含量以及SOD、POD和CAT活性呈显著正相关，在所有模块中相关性最高（图2G和表S5）。此外，样本DEGs与模块的相关性分析显示，棕色模块与HTR的DEGs的相关性最高（图2H和表S6），这表明棕色模块中的关键基因在HTR响应盐碱胁迫中发挥重要作用，因此研究者将该模块作为研究重点。研究者对棕色模块内基因进行KEGG和同源蛋白簇（COG）功能富集分析，结果显示富集到5条KEGG通路：植物-病原体互作（15）、植物激素信号转导（10）、戊糖-葡萄糖醛酸相互转化（7）、类黄酮生物合成（7）以及淀粉和蔗糖代谢（7）（图S7）。例如，在戊糖-葡萄糖醛酸相互转化通路中，VvPME53（gene-VitviT2T_016448，log₂FC=3.81）、VvPME54（gene-VitviT2T_016209，log₂FC=3.77）和VvPME34（gene-VitviT2T_025559，log₂FC=0.61）均表达上调。这些基因编码果胶甲酯酶（PMEs），催化果胶去甲基化，提高果胶的溶解度并促进细胞壁松弛。此外，VvBXL1（gene-VitviT2T_011507，log₂FC=2.06）也表达上调；它在半纤维素代谢和果胶侧链修饰中发挥作用（表S7）。排名前三的COG功能类别是碳水化合物转运与代谢（21；16.67%）、脂质转运与代谢（15；11.9%）和一般功能预测（15；11.9%）（图S8）。戊糖和葡萄糖醛酸是细胞壁果胶、半纤维素和多糖的重要组分。在盐碱等胁迫下，该通路参与细胞壁组分的合成与修饰。此外，研究者使用Cytoscape软件根据网络拓扑参数（包括度、介数中心性和径向性）对基因进行排序，所有排序数据和拓扑参数列于表S8。研究者将度值大于110的基因定义为核心基因，鉴定出9个核心基因作为共表达网络的中心节点，用于筛选与盐碱胁迫响应相关的候选基因。在棕色模块的核心基因中，gene-VitviT2T_000981（VvExpA10，在棕色模块所有基因中度排名第6（前4%），介数中心性排名第7（前4.7%），径向性排名第6（前4%））、gene-VitviT2T_023545（VvSBT4.14）和gene-VitviT2T_005020（VvCSLC5）调控细胞壁松弛。此外，还鉴定出长链酰基辅酶A合成酶A（Newgene-3045，LACS1）、激酶家族C2/C3（gene-VitviT2T_026465）、富含半胱氨酸的类受体激酶（gene-VitviT2T_014855，VvCRK10）、类受体激酶（gene-VitviT2T_021982，VvRLK）以及烃类响应主调控因子（gene-VitviT2T_026847，VvMIZI）（图2I）。ExpA10、SBT4.14和CSLC5通过调控细胞壁生物合成、降解和组织发育相关基因来影响细胞壁结构，从而调节植物生长和胁迫适应。研究者进一步检测关键下游细胞壁生物合成基因的表达水平发现，木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶蛋白27（VvXTH27）、果胶酯酶53（VvPME53）、纤维素合酶A催化亚基3（VvCESA3）和扩展蛋白A8（VvExpA8）的表达水平在HTR中均显著上调（P<0.05）（图S9）。这些结果表明，在盐碱胁迫下，HTR能够通过调控上述参与细胞壁合成与修饰的关键基因的表达，调节细胞壁组分含量和结构稳定性，最终增强葡萄对盐碱胁迫的抗性。

图2. 葡萄叶片在盐碱胁迫下差异表达基因（DEGs）的分析。（A）HTR和YY葡萄叶片在CT和SA处理下转录组数据的主成分分析（PCA）。（B）HTR（CT vs SA）和YY（CT vs SA）中显著上调和下调的DEGs数量。（C）HTR（CT vs SA）和YY（CT vs SA）中DEGs的维恩图。（D）加权基因共表达网络分析（WGCNA）的软阈值筛选。（E）基因聚类树形图和模块分配。（F）各模块中的DEGs数量。（G）基因模块与生理指标的相关性。（H）模块与样本的相关性。（I）棕色模块的基因调控网络分析。HTR：‘和田红’；YY：‘甬优1号’；CT：对照；SA：盐碱胁迫。

3   响应盐碱胁迫的差异表达miRNAs（DEMs）的鉴定

研究者对12个小RNA文库进行测序，每个样本获得19.05 M（19049488-65670634）条干净读取序列。GC含量≥48.28%，Q30碱基百分比为95.15%。各样本的干净读取比对到参考基因组Vitis_vinifera.GCA_030704535.1的比对效率是66.24%-79.68%（表S9）。miRNA的首位碱基偏好为U，与miRNA碱基偏好规则一致，表明miRNA测序数据质量高且可靠（图S10-11）。样本间一致的相关性及良好的重复性（图3A）证明了miRNA-seq数据的高质量。通过与miRBase 18.0数据库（http://www.mirbase.org）比对，在所有样本中鉴定出480个miRNA，包括来自46个家族的170个已知miRNA（表S10）和310个新miRNA。最知名的miRNA家族包括vvi-miR169（20个成员）、vvi-miR156（9个）、vvi-miR166（8个）、vvi-miR171（8个）、vvi-miR160（5个）和vvi-miR162（1个）（表S11）。此外，已知miRNA和新型miRNA的sRNA长度范围是21-24 nt，其中21 nt和24 nt的sRNA在12个文库中最为丰富（图S12）。

BLAST分析预测了480个miRNA的5,782个靶基因，并进行了功能注释。GO 富集分析显示，分子功能中的前三类是：结合、催化活性和转运活性；生物过程中前三类是：细胞过程、代谢过程和单一生物体过程；细胞组分中前三类是：细胞、细胞组分和细胞器（图S13）。KEGG通路富集分析显示，显著富集于代谢通路，包括植物-病原体互作、剪接体、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢以及氨基糖和核苷酸糖代谢（图S14）。

研究者以|log2(FC)|≥1.00和P-value≤ 0.05作为差异表达miRNAs（DEMs）的筛选标准，在盐碱处理后的HTR中鉴定出126个DEMs（82个上调和44个下调）。在YY中鉴定出54个DEMs（17个上调和37个下调）（图3B）。维恩图分析显示，在HTR CT vs. HTR SA和YY CT vs. YY SA之间共有26个保守的DEMs（图3C）。图3D显示共有的DEMs的表达热图。分析结果显示，26个共有的DEMs和2307个靶基因之间存在4,138对互作关系。研究者对2307个靶基因进一步KEGG富集分析，结果显示它们富集于初级代谢、类黄酮生物合成、抗坏血酸和己糖醛酸代谢、过氧化物酶体以及角质、木栓质和蜡质的生物合成（图3E）。这表明这些KEGG代谢通路可能在葡萄响应盐碱中发挥关键作用。

为构建参与盐碱胁迫响应的miRNA-mRNA调控网络，研究者利用关键的盐碱响应DEMs和DEGs构建了一个miRNA-mRNA互作网络。研究者共鉴定出146个miRNA-mRNA对，涉及21个DEMs和91个DEGs。代表性的靶标对包括vvi-miR395a和gene-VitviT2T_000981、novel_miR_22和gene-VitviT2T_018698（MIK2）、novel_miR_6和gene-VitviT2T_016271（CYP92C6）、novel_miR_167和gene-VitviT2T_002450，以及novel_miR_23和gene-VitviT2T_003721（LECRK4）（图3F）。此外，DEMs负调控靶基因的表达，这些预测的DEM-DEG对被认为是葡萄响应盐碱胁迫的候选miRNA-mRNA对（表S12）。研究者鉴定出多个靶基因，它们在植物胁迫响应，特别是在盐碱胁迫中作为核心调控或执行组分。这些基因在不同层面上协调发挥作用，包括信号感知（如MIK2， LECRK4）、ROS清除（如过氧化物酶）、离子和营养稳态维持（如液泡铁转运蛋白， PHO1）以及DNA损伤修复（如BRCA1），从而在逆境条件下维持植物的生存和适应性生长。此外，研究者观察到vvi-miR395a与其靶基因gene-VitviT2T_000981（VvExpA10）之间存在显著的负相关关系。在盐碱条件下，耐盐品种HTR中vvi-miR395a表达量低，而在敏感品种中则相反。研究者进一步RT-qPCR验证了vvi-miR395a和VvExpA10的表达水平（图3G-H）证实了转录组结果。因此，vvi-miR395a-VvExpA10对可能调控HTR葡萄品种的盐碱耐受性。

图3.盐碱胁迫下HTR和YY的差异miRNA分析以及关键DEGs和差异表达miRNA（DEMs）的调控网络构建。（A）样本间miRNA表达水平的相关性分析。（B）显著上调和下调的DEMs数量。（C）DEMs的维恩图。（D）HTR（CT与SA组）和YY（CT与SA组）中共同鉴定出的差异表达miRNA的表达热图。（E）共同DEMs靶基因响应盐碱胁迫的KEGG富集分析。（F） DEGs与DEMs的调控网络。（G-H）vvimiR395a和VvExpA10的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）与测序结果。柱状图表示RTqPCR测定的相对表达量（左Y轴），折线图表示测序获得的FPKM值（右Y轴）。数据以平均值±标准差表示（n≥3）。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验进行多重比较。不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。HTR：‘和田红’；YY：‘甬优1号’；CT：对照；SA：盐碱胁迫。

4 VvExpA10是vvi-miR395a的靶基因

为探究vvi-miR395a在盐碱胁迫下的调控作用，研究者对其靶基因进行了预测。生物信息学分析表明，VvExpA10是vvi-miR395a的一个靶基因（图4A）。STTM395a的示意图如图4B所示（STTM395a是一种短串联靶标模拟物，用于干扰内源vvi-miR395a）。RLM-5′RACE实验进一步验证了vvi-miR395a 在靶标5′端第10个核苷酸处的切割位点（图4C-D）。GUS报告基因实验进一步验证了vvi-miR395a在体内对VvExpA10的调控作用。利用烟草瞬时表达系统验证了vvi-miR395a对VvExpA10的靶向效应。GUS染色分析的重组载体构建示意图如图4E所示。携带不同重组载体的菌株包括：35S:VvExpA10-GUS+35S:Empty、35S:VvExpA10-GUS+35S:MIR395a、35S:VvExpA10-GUS+35S:STTM395a，以及35S:MIR395a。研究者将这四种重组质粒瞬时转化至同一批烟草叶片中。GUS染色结果显示，注射35S:VvExpA10-GUS+35S:Empty和35S:VvExpA10-GUS+35S:STTM395a的叶片呈现蓝色。相反，注射35S:VvExpA10-GUS+35S:MIR395a的叶片中GUS染色强度减弱，注射仅含35S:MIR395a菌液的叶片则无染色（图4F）。GUS酶活性定量检测结果与染色检测中观察到的颜色深浅趋势一致（图4G）。为了排除过表达可能引起的非特异性沉默效应，使用非靶向的乱序miRNA作为阴性对照，证实GUS活性的降低确实是由MIR395a特异性介导的（图S15）。本研究证实，将VvExpA10融合GUS基因与vvi-miR395a共同转化后，vvi-miR395a能够切割靶基因VvExpA10，从而减弱GUS染色强度。这些结果验证了vvi-miR395a以VvExpA10为靶标并抑制其下游调控功能。

图4. vvi-miR395a与其靶基因VvExpA10相互作用的分子验证。（A）使用psRNATarget软件预测vvi-miR395a在VvExpA10 mRNA上的结合位点。（B）用于抑制vvi-miR395a功能的短串联靶标模拟物（STTM395a）载体构建示意图。（C）通过巢式PCR扩增获得切割靶标片段。（D）通过RLM-5′RACE鉴定vvi-miR395a在靶标VvExpA10 mRNA上的切割位点。切割位点以箭头标示，并标注了克隆的频率。（E）本氏烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达实验中载体构建体及染色示意图。（F）共注射不同载体组合的本氏烟草叶片GUS组织化学染色结果（显示了三个独立生物学重复中的代表性结果）。（G）对应（F）中染色叶片的GUS活性定量分析。数据以平均值±标准差表示（n=3）。采用单因素方差分析和Tukey检验进行多重比较，不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

5   vvi-miR395a负调控盐碱耐受性

为验证vvi-miR395a对细胞壁组分的调控功能，研究者构建了过表达vvi-miR395a（vvi-miR395a-OE）的转基因葡萄植株和表达miRNA短串联靶标模拟物（STTM395a）的植株，以及相应的转基因葡萄愈伤组织（图5A、G及图S16A-D）。在盐碱胁迫下，vvi-miR395a-OE叶片出现黄化、萎蔫和落叶现象，而STTM395a植株则表现出相反的表型（图5A）。FTIR分析显示，与vvi-miR395a-OE和野生型（WT）相比，STTM395a根系在3405、2925、1384和1055 cm^-1处的细胞壁组分相关吸收峰更高（图5E和表S13）。在盐碱胁迫下，与WT相比，STTM395a根系中的MDA含量降低，而纤维素和果胶含量升高（图5B-D）。在正常条件下，转基因与WT愈伤组织表型相似。在盐碱胁迫下，WT愈伤组织生长受到抑制，vvi-miR395a-OE生长较慢，而STTM395a生长比WT快（图5G）。RT-qPCR结果显示，vvi-miR395a-OE愈伤组织中vvi-miR395a的表达水平显著高于WT愈伤组织，而STTM395a愈伤组织的表达水平显著降低（图5F）。VvExpA10在vvi-miR395a-OE愈伤组织中表达下调，在STTM395a愈伤组织中表达上调（图5H）。相应地，vvi-miR395a-OE愈伤组织中果胶含量降低、MDA含量升高，而在STTM395a愈伤组织中则相反（图5I-J）。这表明vvi-miR395a负向调控葡萄的盐碱耐受性，而抑制vvi-miR395a可增强葡萄盐碱耐受性。

图5. vvi-miR395a在葡萄根系和愈伤组织中响应盐碱胁迫的功能分析。（A）野生型（WT）、vvi-miR395a过表达和STTM395a葡萄植株在正常条件下以及100 mM（NaCl+NaHCO₃，Na⁺浓度为200 mmol/kg，pH 8.2-8.3）处理21天后的表型。（B）葡萄根系中的纤维素含量。（C）葡萄根系中果胶含量。（D）葡萄根系中丙二醛（MDA）含量。（E）葡萄根系中的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。（F）正常和盐碱胁迫条件下愈伤组织中vvi-miR395a的相对表达量。（G）WT、vvi-miR395a过表达和STTM395a葡萄愈伤组织在正常条件下以及25 mM（NaCl+NaHCO₃，Na⁺浓度为25 mM，pH 8.2-8.3）处理21天后的表型。（H）愈伤组织中VvExpA10的相对表达量。（I）愈伤组织中的果胶含量。（J）愈伤组织中的MDA含量。数据以平均值±标准差表示（n ≥ 3）。采用单因素方差分析和Tukey检验进行多重比较，不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

6 VvExpA10在SA耐受性中发挥正向调控功能

为阐明VvExpA10的功能，研究者构建了过表达VvExpA10（VvExpA10-OE）的转基因葡萄植株和利用CRISPR/Cas9技术构建的VvExpA10敲除植株（VvExpA10-Cas9），以及相应的转基因葡萄愈伤组织（图6A、G及图S16E-H）。在盐碱胁迫下，VvExpA10-OE葡萄叶片仅出现轻微黄化，而VvExpA10-Cas9葡萄叶片则出现萎蔫和生长点发育停滞（图6A）。FTIR分析显示，与细胞壁组分官能团相对应3405、2925、1384和1055 cm^-1处的吸收峰在VvExpA10-OE根系中高于VvExpA10-Cas9和WT（图6E和表S14）。在盐碱胁迫下，与WT相比，VvExpA10-OE根系中的MDA含量降低，纤维素和果胶含量升高（图6B-D）。在正常条件下，转基因与野生型愈伤组织表型相似。在盐碱胁迫下，VvExpA10过表达促进转基因愈伤组织的生长，而敲除则抑制其生长（图6G）。RT-qPCR结果显示，与WT愈伤组织相比，VvExpA10-OE愈伤组织中vvi-miR395a表达水平降低、VvExpA10表达显著升高，而VvExpA10-Cas9愈伤组织中VvExpA10表达则降低（图6F-H）。VvExpA10-OE愈伤组织中果胶和纤维素含量升高、MDA含量降低，而VvExpA10-Cas9愈伤组织中则呈现相反趋势（图6I-J）。这表明盐碱胁迫下VvExpA10的上调表达可调控细胞壁组分，且其过表达能够增强葡萄的盐碱耐受性。

图6. VvExpA10在葡萄根系和愈伤组织中响应盐碱胁迫的功能分析。（A）野生型（WT）、VvExpA10过表达和VvExpA10-Cas9葡萄植株在正常条件下以及100 mM（NaCl+NaHCO₃，Na⁺浓度为200 mmol/kg，pH 8.2-8.3）处理21天后的表型。（B）葡萄根系中的纤维素含量。（C）葡萄根系中的果胶含量。（D）葡萄根系中的MDA含量。（E）葡萄根系的FTIR分析。（F）正常和盐碱胁迫条件下愈伤组织中vvi-miR395a的相对表达量。（G）WT、VvExpA10过表达和VvExpA10敲除（VvExpA10-Cas9）葡萄愈伤组织在正常条件下以及25 mM（NaCl+NaHCO₃，Na⁺浓度为25 mM，pH 8.2-8.3）处理21天后的表型。（H）愈伤组织中VvExpA10的相对表达量。（I）愈伤组织中的果胶含量。（J）愈伤组织中的MDA含量。数据以平均值±标准差表示（n ≥ 3）。采用单因素方差分析和Tukey检验进行多重比较，不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

7   vvi-miR395a通过靶向VvExpA10调控细胞壁组分从而增强盐碱耐受性

为验证vvi-miR395a是否依赖于VvExpA10发挥其调控功能，研究者采取了两步策略：首先，建立过表达VvExpA10（VvExpA10-OE）的转基因葡萄愈伤组织株系；然后以此为遗传背景生成两个衍生系：（i）共过表达vvi-miR395a的株系（vvi-miR395a-OE+VvExpA10-OE），以及（ii）表达miRNA短串联靶标模拟物的株系（STTM395a+VvExpA10-OE）。与WT愈伤组织相比，过表达VvExpA10和抑制vvi-miR395a均增强了盐碱耐受性。转基因愈伤组织中VvExpA10的表达水平和果胶含量均高于WT，而MDA含量则降低。与单独过表达VvExpA10或单独抑制vvi-miR395a相比，同时过表达VvExpA10和抑制vvi-miR395a显著增强盐碱耐受性、提高了果胶含量并上调了VvExpA10基因的表达（图7）。这表明破坏vvi-miR395a的靶位点可防止VvExpA10转录本被切割，从而保留其功能并恢复果胶积累。

vvi-miR395a通过切割VvExpA10 mRNA负向调控果胶积累，进而削弱对细胞壁组分的调控。破坏靶位点则可逆转这一效应，表明vvi-miR395a通过VvExpA10调控细胞壁组分从而增强盐碱胁迫耐受性。

图7. vvimiR395a与VvExpA10复合体在葡萄愈伤组织响应盐碱胁迫中的作用。（A）葡萄愈伤组织在对照及25 mM（NaCl+NaHCO₃，Na⁺浓度为25 mM，pH 8.2-8.3）处理21天后的表型（1：WT，2：vvi-miR395a-OE，3：VvExpA10-OE，4：vvi-miR395a-OE+VvExpA10-OE，5：VvExpA10-OE+STTM395a）。（B和C）葡萄愈伤组织中vvi-miR395a和VvExpA10基因的相对表达水平。（D和E）愈伤组织中的果胶含量。数据以平均值±标准差表示（n≥ 3）。采用单因素方差分析和Tukey检验进行多重比较，不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

讨论

 

多组学联合分析揭示了植物复杂的胁迫响应机制。本研究通过在盐碱胁迫条件下对HTR和YY两个葡萄品种进行生理学、转录组学和miRNA组学分析，并结合功能验证，阐明了葡萄响应盐碱胁迫的生理与分子机制，为植物盐碱胁迫响应机制提供了新见解。

1   HTR与YY在盐碱胁迫下的生理生化变化

土壤盐碱化严重限制了植物的生长、发育、产量和品质。葡萄属于中等盐敏感作物，因此培育耐盐碱品种对于提高葡萄品质和产量至关重要。本研究中，盐碱胁迫抑制了YY的生长，且每个品种表现出明显的形态差异。在盐碱胁迫下，植物通过提高渗透调节物质含量和抗氧化酶活性来应对细胞膜通透性受损。YY的MDA、O₂^-和H₂O₂水平均显著高于HTR，表明其体内ROS大量积累并产生氧化损伤。PRO、SS和SP是维持细胞正常代谢的主要渗透调节物质，HTR中这些调节物质的含量均高于YY。非生物胁迫通常导致细胞内ROS过量积累。为抵御ROS引起的损伤，植物利用包括SOD、CAT和POD在内的酶类清除剂及抗氧化清除机制来调控ROS。HTR植株中SOD、POD和CAT酶活性均较高，表明抗氧化清除能力的增强与抗逆性的提升相关。

盐碱胁迫阻碍叶绿素合成、破坏叶绿体结构并削弱光合作用能力。在盐碱胁迫下，YY的净光合速率和光系统II反应中心均受到严重损伤。叶片叶绿体超微结构成像显示，YY的叶绿体受损、类囊体解体；而HTR的叶绿体结构损伤较轻，叶绿体膜完整，类囊体清晰可见。这些结果表明，在盐碱胁迫下HTR具有更强的ROS清除能力、细胞膜损伤较轻，且对盐碱胁迫的耐受性更强。

2 盐碱胁迫下细胞壁组分的变化

在植物逆境响应过程中，细胞壁作为主要的防御机制，既可作为物理屏障又充当信号受体。细胞壁组分及其相关代谢物对植物抗逆性至关重要。在盐碱胁迫下，细胞壁组分受到调控，细胞壁相关基因表达上调、酶活性升高，进而促进细胞壁重塑。本研究观察到了类似的结果：盐碱胁迫后，抗性品种HTR中纤维素和果胶积累量增加，而敏感品种YY中积累量较低。扩展蛋白的积累通过调节细胞壁松弛，增强了盐碱胁迫下的机械支撑和渗透调节能力。大豆中的研究表明，盐胁迫下GmEXPA17a的表达发生了显著变化。本研究的表达分析表明，盐碱胁迫下，耐盐碱品种HTR中扩展蛋白VvExpA10的基因表达量是CT的9倍，是敏感品种YY的4倍，表明该基因在葡萄盐碱胁迫响应中发挥关键作用。本研究中，棕色模块基因的KEGG富集分析鉴定出多条与细胞壁重塑相关的通路。在戊糖-葡萄糖醛酸相互转化通路中VvPME53、VvPME54、VvPME34和VvBXL1均上调表达，其表达模式与扩展蛋白基因VvExpA10一致。因此，研究者推测这些上调的果胶甲酯酶（PMEs）和β-木糖苷酶（BXL1）可能促进果胶去甲基化和半纤维素代谢，从而为VvExpA10介导的细胞壁松弛提供所需的底物和结构基础。然而，该假说仍需进一步实验验证。此外，参与细胞壁代谢的基因，如丝氨酸蛋白酶（SBT4.14）和细胞壁多糖生物合成基因（CSLC5）在胁迫下也表达上调，进一步调控扩展蛋白和木聚糖的积累。这些物质通过影响细胞壁特性间接增强植物的抗逆性。因此，细胞壁组分及相关碳水化合物代谢物的变化在植物适应盐碱环境中发挥着重要的调控作用。

3   过表达VvExpA10增强转基因葡萄愈伤组织与根系的盐碱耐受性

扩展蛋白是一类参与植物细胞壁扩张的分子，已在多个物种中被鉴定。扩展蛋白可分为四个亚家族：α-EXP（EXPA）、β-EXP（EXPB）、EXP-like A（EXLA）和EXP-like B（EXLB）。RNA测序数据显示，盐碱胁迫诱导了VvExpA10的表达。VvExpA10作为EXPA亚家族的成员，在植物生长发育中发挥重要作用。已有研究表明，沉默GarExpA4可增加棉花对盐胁迫的敏感性。在本研究中，构建了过表达（VvExpA10-OE）和敲除VvExpA10（VvExpA10-Cas9）的愈伤组织与根系株系。盐碱处理后，与WT相比，VvExpA10-OE愈伤组织生长势强，果胶含量升高，MDA水平降低；而VvExpA10-Cas9愈伤组织则表现出相反的效果。这表明过表达VvExpA10增强了抗氧化酶活性，有效清除ROS，降低了脂质过氧化水平。转基因愈伤组织保持了稳定的电导率，细胞膜氧化损伤极小，并保持较强的生长能力。发根农杆菌介导的转基因发根植株也得到了相似的结果，表明过表达VvExpA10增强了植株调控细胞组分的能力，有效减轻了胁迫诱导的损伤。这与先前报道的过表达OsEXPA7通过增强细胞壁伸展性提高水稻耐盐性的研究一致。

4   vvi-miR395a在转基因葡萄愈伤组织和根系中负向调控盐碱耐受性

miR395家族广泛分布于植物界，已在37种植物中被鉴定，分为五个簇，分别代表主要的植物谱系：石松科（苔藓植物）、松科（裸子植物）、豆科、禾本科以及十字花科/蔷薇科（被子植物）。本研究发现，vvi-miR395a是葡萄响应盐碱胁迫的负调控因子。表型和功能分析表明，盐碱胁迫下，在转基因植株中过表达vvi-miR395a抑制了靶基因VvExpA10，破坏了细胞壁稳态，导致叶片萎蔫和生长受阻，从而降低植株的盐碱耐受性。已有研究报道，短串联靶标模拟物（STTM）技术能够有效抑制特定miRNA的表达。本研究中，利用STTM抑制vvi-miR395a的表达后，与WT相比，STTM395a愈伤组织表现出更好的生长势、增加了VvExpA10的表达和果胶含量，降低了MDA含量。相反，vvi-miR395a-OE愈伤组织则表现出相反的表型，表明vvi-miR395a可能负向调控葡萄的盐碱耐受性。此外，本研究未对miR395家族的其他成员进行系统研究，STTM395a是否影响该家族其他成员仍需进一步探究。

5 vvi-miR395a-VvExpA10模块协同调控葡萄盐碱耐受性

VvExpA10被预测是vvi-miR395a的靶基因，其主要功能是参与细胞壁松弛和伸长，从而增强植物对盐碱胁迫的抗性。研究者观察到，vvi-miR395a和VvExpA10均响应盐碱胁迫，进而调控葡萄植株对盐碱胁迫的耐受性（图S10）。vvi-miR395a与VvExpA10-GUS共同转化降低了烟草叶片中的GUS染色强度。而STTM395a或35S:Empty与VvExpA10-GUS共同转化则呈现蓝色，这验证了二者间的靶向切割关系。5′RACE实验进一步确认了切割位点。先前研究表明，miR395通过调控硫代谢转录因子，增加了缺硫植株中硫酸盐同化通路的代谢流。研究表明，果胶沉积和纤维素合成等细胞壁重塑过程对胞外pH高度敏感。盐碱环境的高pH可能影响细胞壁合成与修饰相关酶的活性，这可能是盐碱胁迫下miR395a-VvExpA10模块被显著激活的重要诱因。过表达VvExpA10并抑制vvi-miR395a的愈伤组织比两者共同过表达的愈伤组织表现出更强的盐碱耐受性和更高的果胶含量，这表明破坏vvi-miR395a的靶位点可防止VvExpA10转录本被切割，从而保留其功能、恢复果胶积累并增强盐碱耐受性。

本研究证实，vvi-miR395a-VvExpA10模块通过维持细胞壁完整性增强葡萄盐碱耐受性。本研究阐明了vvi-miR395a与VvExpA10之间的负调控关系，并将该模块整合到植物盐碱响应网络中。尽管本研究的主要结论是vvi-miR395a-VvExpA10模块在愈伤组织中介导细胞壁重塑和盐碱耐受性，但它尚不能完全反映完整植株中复杂的组织特异性互作。后续研究需利用稳定的转基因株系（过表达/抑制vvi-miR395a），在根、茎、叶等分化组织中进行全面验证，并探究其对组织特异性胁迫响应及长距离信号传导的影响。

图8. 经验证的vvi-miR395a-VvExpA10调控模块在葡萄盐碱耐受性。在该示意图中，vvi-miR395a抑制VvExpA10的转录，而VvExpA10通过影响细胞壁组分最终调控葡萄盐碱耐受性。箭头表示正向调控，直线表示抑制，箭头的粗细表示调控作用的强度。

通过整合生理学、转录组学和miRNA组学分析，本研究发现HTR中细胞组分代谢物的积累量及相关基因的表达量均高于YY。此外，共鉴定出21个DEMs和91个DEGs，并预测了相应的miRNA-靶基因表达调控网络。vvi-miR395a-VvExpA10模块通过细胞壁松弛调控葡萄的盐碱耐受性。RLM-5′RACE和GUS实验证实vvi-miR395a直接靶向VvExpA10并确定了切割位点。表达分析显示，vvi-miR395a与VvExpA10在转录水平上呈负相关关系。功能验证结果表明，盐碱胁迫下vvi-miR395a表达的降低减弱了其对VvExpA10的靶向作用，增强了植物对细胞壁组分及相关代谢过程的调控能力，从而提高了葡萄的盐碱耐受性。本研究证实了vvi-miR395a-VvExpA10调控模块参与葡萄响应盐碱胁迫，为解析植物盐碱耐受的分子机制提供了新的见解（图8）。