Molecules：不同气候条件下两个葡萄品种果实成熟过程中花色苷积累与细胞抗氧化活性的动态变化

不同气候条件下两个葡萄品种果实成熟过程中花色苷积累与细胞抗氧化活性的动态变化

期刊：Molecules（4.6）

发表日期：2022年

 

摘要

作为广受欢迎的浆果类水果，葡萄被广泛种植并加工成葡萄干、葡萄酒等产品。为探究不同气候条件对葡萄着色和品质形成的影响，本研究选取了两个常见葡萄品种‘红地球’和‘新玉’进行研究。葡萄分别种植于中国乌鲁木齐和吐鲁番的两种不同气候条件下（温带大陆性干旱气候和温带大陆性沙漠气候），并采集了五个发育阶段的果实。测定结果显示，乌鲁木齐的平均日温和光照强度均低于吐鲁番。与吐鲁番的葡萄果实相比，乌鲁木齐葡萄果实的亮度值（L*）更低，红绿值（a*）更高。RT-qPCR分析表明，乌鲁木齐葡萄果实中与花色苷生物合成相关的关键基因转录水平更高，这与其中更丰富的酚类物质，尤其是花色苷的含量一致。体外最大抗氧化活性和细胞抗氧化活性也均在乌鲁木齐葡萄果实中观察到。这些研究结果揭示了气候对葡萄花色苷积累及抗氧化能力的影响，这可能会扩大我们对葡萄浆果品质形成的认识，并有助于培育营养价值更高的葡萄。

引言

葡萄（Vitis vinifera L.）富含碳水化合物、有机酸和矿物质，是全球最著名的水果之一。此外，先前的研究也表明葡萄含有宝贵的生物活性物质，包括酚酸、黄酮类和花色苷。花色苷是构成葡萄果皮颜色的主要色素之一。花色苷可以保护植物免受可见光和紫外线损伤及害虫侵害，从而提高果实品质。不同的流行病学和临床前研究已证实，富含酚类物质（如花色苷）的食物可以降低人类患慢性疾病的风险。因此，生物活性物质和颜色是衡量葡萄品质和成熟度的重要指标。

据报道，葡萄浆果中花色苷的浓度和组成受环境因素影响，包括温度、光照和水分。例如，大多数葡萄品种的花色苷含量随光照强度增加而增加，但过度曝光会导致浆果晒伤，并抑制某些品种的花色苷积累。光照通过相对上调LAR1、LAR2和ANR基因，促进葡萄果皮中原花青素和花色苷的组成。同样，适宜的温度也能促进花色苷的合成，而在极端高温下花色苷含量会降低。转色期夜间低温（10-11°C）促进了‘Corvina’葡萄的花色苷合成，CHS3、F3H1、MYBA1和UFGT的转录表达增强。温度还通过调节碳水化合物的代谢来影响花色苷含量。低温与可溶性化合物的协同作用促进了‘Aki Queen’葡萄的花色苷合成。此外，一些研究也证实，过高温度会加剧葡萄浆果中花色苷的分解。

乌鲁木齐和吐鲁番是中国新疆两个主要的葡萄产区，‘红地球’（RG）和‘新玉’（XY）葡萄是两个常规栽培品种。乌鲁木齐属于温带大陆性干旱气候，而吐鲁番属于温带大陆性沙漠气候。近年来，研究者综述了气候对葡萄成熟度和品质的影响，特别是高温的影响。然而，不同气候如何影响葡萄发育期间的着色尚未得到研究。此外，关于浆果着色对其品质影响的报道则更少。在本研究中，我们比较了乌鲁木齐和吐鲁番两个葡萄品种在五个生长期内的果实颜色、酚类物质（包括花色苷）的积累以及细胞抗氧化活性，旨在探究气候对葡萄着色和品质形成的影响。本研究可能加深我们对气候如何影响葡萄品质发育的认识。

结果与讨论

2.1. 乌鲁木齐与吐鲁番的气候条件

记录了乌鲁木齐和吐鲁番从2018年7月2日至2018年9月14日的日温度、光照强度和湿度，见补充图S1。吐鲁番和乌鲁木齐的平均日温分别在40°C和30°C左右波动，平均日光照强度分别在800 µmol·m−2·s−1和500 µmol·m−2·s−1左右波动，平均日湿度分别在40%和50%左右波动。测定结果显示，与乌鲁木齐相比，吐鲁番具有更高的温度、更高的光照强度和更低的湿度。

 

2.2. 乌鲁木齐与吐鲁番葡萄浆果的色差值

乌鲁木齐和吐鲁番地区‘红地球’（RG）和‘新玉’（XY）葡萄浆果在五个发育阶段（S1、S2、S3、S4、S5）的色差值见补充表S1。在乌鲁木齐和吐鲁番地区，两个不同品种的葡萄浆果随每个发育阶段着色加深，但吐鲁番的葡萄浆果在每个发育阶段的着色均浅于乌鲁木齐的浆果（补充图S2）。随着浆果发育时间的延长，浆果的L*值显著降低，且乌鲁木齐葡萄浆果的L*值低于吐鲁番种植的浆果。L*值在不同品种间也存在差异，RG葡萄浆果的L*值低于XY葡萄浆果。乌鲁木齐浆果的a*值在初期增加，然后在葡萄成熟时下降，而吐鲁番浆果的a*值在发育期间呈上升趋势。在RG葡萄中，乌鲁木齐浆果在三个早期发育阶段的a*值高于吐鲁番浆果。对于XY葡萄，乌鲁木齐浆果在S2、S3和S4阶段的a*值高于吐鲁番浆果。两个品种在不同地区的a*值变化规律存在明显差异。浆果的ΔE和b*值逐渐下降，且在葡萄发育后期，乌鲁木齐浆果的b*值低于吐鲁番浆果。

色差值是评价葡萄浆果颜色的重要指标。L*值越小，a*值越大，说明葡萄果皮着色程度越深。在本研究中，随着葡萄成熟，浆果的红色加深（补充图S2）。乌鲁木齐葡萄浆果明显比吐鲁番葡萄浆果更红，且其a*值更大。分析表明，不同气候不仅影响L*值，还改变了葡萄浆果发育过程中a*值的变化趋势。先前的研究也表明，根系温度越低、磷含量越低，红叶生菜叶片的红色越深、亮度越低，a*值越大，L*值越小。在我们的结果中，生长在温度较低的乌鲁木齐地区的葡萄浆果，与吐鲁番相比，在发育过程中相应地具有更低的L*值和更高的a*值。

 

2.3. 乌鲁木齐与吐鲁番葡萄浆果的基因表达

通过RT-qPCR对来自吐鲁番和乌鲁木齐的葡萄浆果中参与花色苷生物合成的主要基因进行了基因表达研究。花色苷生物合成途径及PAL、4CL、CHS2、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS和ANR基因的相对表达水平如图1所示。RG和XY葡萄浆果基因的平均表达率计算为这些关键基因在每个阶段与吐鲁番S1阶段相对表达的比值。PAL是葡萄浆果合成花色苷的第一个基因。总体而言，每个样品中PAL的表达最初一致下调，随后在后期呈上调趋势。总体上，乌鲁木齐浆果中4CL的表达在S4达到最大值，而在吐鲁番浆果发育期间下调。对于CHS2，在成熟后期发现较高的表达水平。CHI在S4或S5阶段的相对表达水平最高。除了RG-U葡萄外，CHI在葡萄发育期间持续上调。此外，F3H的表达在发育中期轻微上调，并在葡萄成熟后呈现下调。F3′H和F3′5′H的相对表达均呈现波动趋势。至于DFR，其表达水平在S5达到第一个峰值，在S1达到第二个峰值。ANS的表达随着浆果的发育而上调，直到S5下调。即使ANR在早期有轻微上调，其在成熟后期的表达仍显著下降。

这些关键基因的表达既受转录因子影响，也受环境因子影响。光照和温度是最重要的环境因子。花色苷生物合成途径的上游基因（包括PAL、4CL、CHS2、CHI）的表达在两个葡萄品种的早期发育阶段（S1至S3）保持相对稳定，而在成熟阶段（S4和S5）发生显著变化。下游基因（DFR和ANS）的表达在不同地区的浆果早期发育阶段发生变化。至于作为原花青素生物合成关键转折点基因的F3H，其在乌鲁木齐地区两个品种中的表达持续较高。先前的研究已证实，特定的光照条件有助于葡萄浆果中花色苷合成关键基因的表达。光照可以正向调节葡萄中PAL和F3H（VIT_18s0001g14310）的表达，而负向调节CHS、F3H（VIT_04s0023g03370）和F3′5′H的表达。套袋导致的弱光条件可通过影响光响应因子VoHY5和VvCOP1，下调葡萄中CHS2、CHI、F3′H、F3′5′H、DFR和ANS的表达。然而，在我们的研究中，温度更高、光照更强的吐鲁番地区葡萄浆果中PAL、4CL、DFR、F3H、F3′5′H和ANS的表达较低。推测高温抑制了它们的表达。与25°C相比，35°C的温度阻碍了葡萄中DFR和ANS的表达。夜间高温抑制了葡萄成熟早期CHS、F3H、DFR和ANS的基因表达。这些研究表明，大多数与花色苷合成相关的基因受环境因素调控。

 

 

2.4. 乌鲁木齐与吐鲁番葡萄浆果的酚类化合物（如花色苷）

如表1所示，在葡萄浆果中鉴定并定量了十种酚类化合物，包括儿茶素、阿魏酸、表儿茶素以及原花青素B1和B2，以及五种花色苷，包括飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷。总体而言，儿茶素、阿魏酸、表儿茶素以及原花青素B1和B2的含量随葡萄发育而下降。有趣的是，两个葡萄品种中的表儿茶素在乌鲁木齐浆果中呈现先上升后下降的趋势，最高含量出现在S2阶段。对于RG葡萄，乌鲁木齐浆果中儿茶素和阿魏酸的含量分别在S1、S2、S5阶段和S1、S2、S3阶段高于吐鲁番浆果。乌鲁木齐葡萄浆果的原花青素B1含量也较高，尽管原花青素B2的含量在不同地区间没有明显规律。除了S2阶段外，表儿茶素的含量在吐鲁番葡萄浆果的所有生长阶段均较高。对于XY葡萄，乌鲁木齐浆果中儿茶素和阿魏酸的含量显著高于吐鲁番。此外，除S1阶段外，乌鲁木齐浆果含有更多的表儿茶素。测得的原花青素含量与RG葡萄浆果相似。总体而言，XY葡萄浆果比RG葡萄浆果积累了更多的儿茶素、阿魏酸以及原花青素B1和B2，而表儿茶素则呈现相反的模式。

 

 

根据先前研究，儿茶素、表儿茶素、阿魏酸和原花青素已在葡萄中被鉴定。Gonzalez等人也报道，李子中的儿茶素和原花青素在果实成熟过程中减少。适宜的光照条件和温度有助于葡萄浆果中酚类化合物的合成。遮荫条件下生长的葡萄浆果中黄烷醇含量较低。与20°C相比，25°C更有利于‘Kadainou R-1’葡萄浆果中黄烷-3-醇的合成。在本研究中，乌鲁木齐葡萄浆果含有更多的儿茶素和阿魏酸。结果表明，在一定光照条件下，浆果中酚类化合物的积累明显受温度调控。然而，表儿茶素含量的变化因不同葡萄品种中表儿茶素合成对温度和光照的不同反应而异。乌鲁木齐和吐鲁番葡萄浆果的原花青素B1和B2含量没有明显差异。一篇综述总结，葡萄皮中的原花青素受白天高温调控，而种子成分通常因非生物因素变化很小。

可以观察到，葡萄浆果中的所有花色苷化合物随着葡萄发育持续上升，并在S3或S4阶段达到最大值（表1）。飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷的含量也呈现相同的趋势。在RG葡萄发育过程中，乌鲁木齐和吐鲁番浆果的总花色苷含量范围分别为从6.38 ± 0.34 µg/g FW到38.03 ± 0.68 µg/g FW以及从1.19 ± 0.08 µg/g FW到8.63 ± 0.21 µg/g FW（S4）。从S3到S5，乌鲁木齐浆果中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷的含量高于吐鲁番浆果。在吐鲁番浆果中，整个发育期间未检测到飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷。在XY葡萄发育过程中，乌鲁木齐和吐鲁番浆果的总花色苷含量显著增加，分别高达46.78 ± 1.10 µg/g FW（S3）和11.68 ± 0.23 µg/g FW（S2）。两个品种的花色苷积累变化在两个地区的浆果发育过程中呈现相同的趋势。尽管在乌鲁木齐的RG浆果中检测到更高的花色苷含量，但生长在吐鲁番的XY葡萄在S1和S2阶段含有更多的花色苷。当生长在乌鲁木齐时，XY葡萄而非RG葡萄呈现出更丰富的花色苷含量，这表明XY品种对气候变化可能更敏感。

芍药素-3-O-葡萄糖苷是RG和XY葡萄浆果中的主要花色苷。显然，尽管观察到花色苷含量存在品种依赖性的时间进程变化，但总体而言，生长在吐鲁番的两个品种的浆果其花色苷含量显著低于乌鲁木齐葡萄浆果，这可能是乌鲁木齐平均温度较低的结果（补充图S1）。据报道，在模拟大田作物升温条件下，‘Malbec’和‘Bonarda’葡萄的总花色苷含量显著低于对照组。已证实，即使在两个品种对温度的反应不同，低温也能极大地促进葡萄转色后的花色苷积累。此外，转色期前后的降温处理加速了浆果在凉爽夜间温度下的花色苷积累。然而，温差和光照强度也是影响植物花色苷合成的重要环境因素。显然，在吐鲁番观察到更强的光照强度和更大的温差（补充图S1）。在一定温度范围内，较高的日温和适当的光照强度有助于更强的光合作用，从而为花色苷合成提供前体。‘赤霞珠’葡萄的花色苷积累随光照增加而增加，直至100 mmol·m−2·s−1 。最近的研究证实，葡萄的花色苷含量随透光率增加而降低。然而，在我们的研究中，吐鲁番更强的光照并未伴随着更高的花色苷含量。植物中花色苷的积累受多种环境因素调控。早在2002年，研究已证明花色苷的积累更多是温度而非光照的函数。

 

2.5. 乌鲁木齐与吐鲁番葡萄浆果的抗氧化活性

从图2A可以看出，两个地区RG和XY浆果的ORAC值所代表的总抗氧化活性在葡萄成熟过程中持续下降。然而，乌鲁木齐浆果的ORAC值显著更高。葡萄浆果细胞抗氧化活性（CAA）值的变化如图2B和2C所示。结果与ORAC值相似。样品在S1阶段显示出最大的细胞抗氧化活性，随后在S5阶段降至最低。与吐鲁番浆果相比，乌鲁木齐浆果在每个生长阶段的CAA值均明显更高（p < 0.05）。总体而言，PBS洗涤方案下的CAA值低于未PBS洗涤方案下的值。乌鲁木齐浆果的细胞摄取率呈现上升趋势，而吐鲁番浆果则呈现下降变化（图2D）。此外，乌鲁木齐浆果的细胞摄取率高于吐鲁番浆果。

 

 

酚类化合物与抗氧化能力之间存在很高的相关性[26]。DPPH测定法已显示葡萄浆果具有抗氧化活性。在我们的工作中，应用ORAC测定法和CAA测定法测量抗氧化活性，结果显示抗氧化活性在成熟过程中下降。由于涉及细胞摄取、代谢以及抗氧化剂在细胞内的定位等方面，CAA测定法比流行的化学抗氧化活性测定法更具生物学相关性。在ORAC测定法和CAA测定法中，种植在乌鲁木齐的葡萄浆果的抗氧化活性均优于吐鲁番。推测乌鲁木齐葡萄浆果含有更多的酚类化合物，尤其是花色苷。Wang等人发现，酚类含量较低的蓝莓其ORAC和CAA值更差。花色苷与抗氧化能力之间的关系先前已得到证实。

 

2.6. 乌鲁木齐与吐鲁番葡萄浆果的细胞毒性与抗增殖活性

葡萄浆果提取物的CC50值很高，高达80 mg/mL（结果未显示）。这一结果说明，在测试抗增殖活性的浓度下，葡萄浆果提取物未显示细胞毒性。由EC50值表示的葡萄浆果抗增殖活性见补充表S2。无论品种和地区，葡萄浆果的抗增殖活性在葡萄成熟过程中均下降。乌鲁木齐浆果的抗增殖活性高于吐鲁番浆果。

许多先前的报告表明，大量摄入葡萄浆果的酚类化合物可能与降低癌症风险相关，这是因为葡萄浆果抗氧化剂发挥潜在抗癌作用的机制，包括抗氧化、抗炎和抗增殖活性。在我们的研究中，据报道葡萄浆果对HepG2细胞具有抗增殖作用。含有更高酚类和花色苷的乌鲁木齐浆果具有更好的抗增殖活性。不同的蓝莓提取物可以抑制HepG2细胞增殖，并与花色苷含量的变化保持正相关。草莓中的花色苷可能在预防和治疗乳腺癌中发挥作用，最终通过抑制癌细胞的增殖和转移来触发乳腺癌细胞凋亡。

 

2.7. 相关性分析

葡萄浆果中成分与其合成途径关键基因的Pearson相关性分析如图3A所示。F3H、F3′5′H、ANS和ANR的转录水平与酚类物质呈正相关，而大多数基因的相对表达与花色苷呈明显正相关。推测PAL和4CL是调控葡萄浆果花色苷合成的主要基因，因为它们与大多数花色苷成分显著相关，可能对环境胁迫，特别是浆果成熟期间的生长温度更为敏感。葡萄浆果成分与色差值的Pearson相关性分析如图3B所示。此外，观察到花色苷与a*值之间存在显著正相关，而花色苷含量与L*和b*值显著负相关。这也验证了花色苷是葡萄浆果红色的重要呈色物质。葡萄浆果酚类成分与活性的Pearson相关性分析如图3C所示。PBS洗涤方案下的CAA值、未PBS洗涤方案下的CAA值和ORAC值与酚类化合物呈显著正相关，尽管它们的值与花色苷之间没有明显相关性。细胞摄取率和抗增殖活性与酚类物质（包括花色苷）呈正相关。葡萄浆果成分之间的Pearson相关性分析如图3D所示。酚类物质之间存在强相关性。此外，花色苷彼此相关。观察总花色苷（AC）的关系，原花青素B1和B2与AC负相关，而各类花色苷均同时与AC高度相关。

 

 

2.8. 葡萄浆果的主成分分析（PCA）与聚类分析

进行PCA以进一步比较不同生长条件对葡萄浆果成分的影响（图4A）。在葡萄浆果中，PC1和PC2的贡献值分别为58.02%和29.23%。发育后期的葡萄浆果被分类到第一和第四象限，而S1和S2阶段的浆果位于第二和第三象限。如前所示，花色苷是乌鲁木齐葡萄浆果中更突出的成分，而酚类物质是S1葡萄浆果中更突出的成分。结果进一步证实了乌鲁木齐葡萄浆果含有更多的花色苷。

通过成分聚类将20个葡萄浆果样品分为三组（图4B）。第一组包括RG-TS1、RG-US1、RG-US2、XY-TS1、XY-US1和XY-US2，这些主要是吐鲁番和乌鲁木齐酚类化合物含量较高的早期葡萄浆果；其他样品聚类到第二组，并根据生长区域细分为两个亚组。主要地，生长在乌鲁木齐的样品含有更多的花色苷。聚类分析结果显示，两个地区的葡萄浆果成分在早期葡萄发育阶段基本相似。在葡萄发育后期，乌鲁木齐浆果的花色苷含量高于吐鲁番浆果。结果表明早期葡萄浆果中含有更丰富的酚类化合物；此外，它们表明环境对葡萄浆果的组成有显著影响，并且在温度和光照强度较低的地区，葡萄花色苷的积累显著更高。

 

材料与方法

3.1. 材料

实验选取了新疆农业科学院吐鲁番和乌鲁木齐试验基地五个发育阶段（S1、S2、S3、S4和S5）的‘红地球’（RG）和‘新玉’（XY）葡萄浆果。乌鲁木齐和吐鲁番葡萄浆果分别在开花后47天和45天首次采集。其他采样时间见补充表S3。不同地区各发育阶段采摘葡萄浆果的照片见补充图S1。葡萄浆果分为四组：RG-U（乌鲁木齐‘红地球’葡萄）；RG-T（吐鲁番‘红地球’葡萄）；XY-U（乌鲁木齐‘新玉’葡萄）；XY-T（吐鲁番‘新玉’葡萄）。每组包括15株形状相同的葡萄树，每株保留15串浆果。每个阶段采样5-10串；称量600克大小相同、颜色均匀、无病害的浆果，进行三次生物学平行。样品采集后迅速用液氮冷冻。所有葡萄浆果在分析前储存在-80°C。

 

3.2. 试剂与化学品

儿茶素、阿魏酸、表儿茶素、槲皮素、2,2'-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（ABAP）、Trolox和Folin-Ciocalteu试剂购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯市）。原花青素B1、原花青素B2、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和锦葵素-3-O-葡萄糖苷购自Weikeqi生物技术有限公司（中国四川成都）。HPLC级试剂购自安谱实验科技股份有限公司（中国上海）。Williams' E培养基、PBS和胰蛋白酶-EDTA溶液购自Gibco（Life Technologies，美国纽约州格兰德岛）。人肝癌细胞系HepG2（ATCC HB-8065）购自ATCC公司（美国弗吉尼亚州马纳萨斯市）。本工作中使用的其他化学品和试剂均为分析纯。

 

3.3. 色差值测定

使用色差计（Chroma Meter II Reflectance CR-300 triple，Konica Minolta Holdings, Inc.，日本大阪）测定葡萄浆果的颜色。测量三个参数的色差值来表征葡萄浆果的颜色：（1）亮度值L*，L*越大表示亮度越高；否则越暗；（2）红绿值a*，-a*表示绿色，+a*表示红色；（3）黄蓝值b*，-b*表示蓝色，+b*表示黄色。总色差值通过以下公式计算：ΔE = √[(L - L0)2 + (a - a0)2 + (b - b0)2]。

 

3.4. 总RNA提取、逆转录与RT-qPCR分析

使用RNAprep Pure Plant Kit（DP441）（天根，中国北京）提取葡萄浆果的总RNA，并使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录为cDNA。RT-qPCR使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green），参照制造商说明书（天根，中国北京）进行，并使用LightCycler® 480 Real-Time PCR系统（F.Hoffmann-La Roche Ltd，瑞士）完成。RT-qPCR中使用的引物核苷酸序列见补充表S4。泛素基因被视为内参基因。使用基于三次技术重复的2−ΔΔCt方法分析转录水平。

 

3.5. 葡萄浆果酚类物质提取

葡萄酚类物质采用先前报道的方法提取。简言之，取20克样品（三次重复），用200 mL甲醇/冰乙酸（5:1，v/v）提取。均质化（12,000 rpm，2分钟）后，提取物在4°C保存过夜。所有提取物在45°C蒸发，用甲醇重新溶解，并保持在-20°C以备分析。

 

3.6. 酚类物质（如花色苷）的测定

使用配备二极管阵列检测器（Waters, LC 2998，美国马萨诸塞州米尔福德）的HPLC和C18色谱柱（Waters，250 * 4.6 mm，5 μm），在35°C下，按照先前的实验分析[32]测定酚类物质（如花色苷）。简言之，酚类化合物的分析在280 nm波长下进行，流动相（A，水中含0.1%三氟乙酸；B，乙腈）梯度洗脱如下：0至5分钟，90% A；5至20分钟，90%至75% A；20至25分钟，75%至65% A；25至31分钟，65%至42% A；31至34分钟，42%至40% A；34至40分钟，40%至10% A；40至50分钟，10%至90% A；50至53分钟，90% A。数值以“mg/100 g FW”表示。此外，花色苷的分析在520 nm波长下进行，流动相如下：0至5分钟，90% A；5至25分钟，90%至75% A；25至27分钟，75%至65% A；27至30分钟，65%至10% A；30至32分钟，10%至90% A；32至37分钟，90% A。数值以“µg/g FW”表示。数据报告为三次重复分析的平均值±标准差（n = 3）。

 

3.7. 抗氧化活性测定

体外抗氧化活性通过氧自由基吸收能力（ORAC）测定法测定，以每100克鲜重的Trolox当量微摩尔数（µmol TE/100 g FW）表示。使用Trolox作为标准品。葡萄浆果的抗氧化活性也通过细胞抗氧化活性（CAA）测定法测定，以每100克鲜重的槲皮素当量微摩尔数（µmol QE/100 g FW）表示。使用槲皮素作为标准品。数据报告为三次重复分析的平均值±标准差（n = 3）。

 

3.8. 细胞毒性测定与抗增殖活性测定

按照先前描述的方法检测葡萄浆果的细胞毒性活性和抗增殖活性。细胞培养方法与CAA测定中使用的类似。数据报告为三次重复分析的平均值±标准差（n = 3）。样品的细胞抗增殖活性和细胞毒性分析分别以EC50 mg/mL和CC50 mg/mL表示。

 

3.9. 统计分析

数据表示为三次重复分析的平均值±标准差。使用IBM SPSS 25.0（IBM，美国纽约州阿蒙克）进行ANOVA统计分析，并采用Duncan多重比较检验评估结果。使用Pearson相关系数方法进行相关性检验和聚类分析。使用均值中心化和缩放后的数据进行主成分分析（PCA），以阐明不同品种和发育阶段葡萄浆果成分之间的关系。

结论

总之，我们评估了两种葡萄浆果在五种自然生长阶段、不同气候条件下生长时的花色苷积累和抗氧化活性。气候对葡萄浆果的花色苷代谢和抗氧化品质具有显著影响。乌鲁木齐地区光照强度、温度和湿度较低的气候条件，导致了葡萄发育过程中更高的红色度，并被认为更有利于酚类物质，特别是花色苷的积累。生长在乌鲁木齐的葡萄浆果的抗氧化活性大于吐鲁番葡萄浆果。这些结果有助于全面理解气候条件对葡萄花色苷积累和品质形成的影响，从而可为葡萄栽培、采收和加工提供参考。