Food Chem：非靶向代谢组学分析鉴定葡萄酒后发酵浸渍过程中释放的新甜味化合物

非靶向代谢组学分析鉴定葡萄酒后发酵浸渍过程中释放的新甜味化合物

期刊：Food Chemistry（9.8）

发表日期：2024年12月

 

 

研究摘要

 

葡萄酒的感官品质主要取决于其香气与风味，甜味对红葡萄酒的味觉平衡具有重要作用。本研究基于酵母自溶过程中葡萄酒甜味会增强（与红葡萄酒酿造中发酵后浸渍过程相伴发生）等经验观察，开展了甜味相关化合物的探究。研究建立了基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的非靶向代谢组学方法，以发现该阶段释放的新型甜味分子。在筛选出的多个标志物中，通过多种分离技术分离得到一种化合物，经核磁共振（NMR）明确鉴定为N6-琥珀酰腺苷（N6-succinyl adenosine）。该化合物首次在葡萄酒中被报道，在85款红葡萄酒中的平均含量为3.16 mg/L，且感官分析证实其具有甜味。本研究不仅发现了葡萄酒中一种新型甜味化合物，还为研究天然基质中的味觉活性化合物提供了新工具。

 

 

研究背景

 

葡萄酒的感官特征由视觉外观、触觉感受、嗅觉及味觉成分构成，在很大程度上决定了消费者的品鉴体验。干型葡萄酒的味觉平衡涉及三种风味：酸味、苦味和甜味。其品质取决于葡萄本身的成分，以及酿酒师专业技艺所赋予的葡萄转化过程。在红葡萄酒酿造过程中，传统工艺会在酒精发酵完成后，让葡萄酒继续与葡萄的固体部分保持接触，这一步骤被称为发酵后浸渍（PFM），该阶段会发生两种现象：一是酵母在酶促作用下发生自溶，二是葡萄固体部分中的物质被选择性提取到葡萄酒中。

从感官角度来看，红葡萄酒的甜味会在发酵后浸渍过程中增强。感官研究也证实，酒精发酵后让红葡萄酒与酵母保持接触，会产生此类风味变化。此外，葡萄酒与葡萄固体部分的接触也被认为具有增甜作用。这些感官现象已在分子层面得到部分解释，已知Hsp12蛋白衍生肽、表二氢phaseic酸-3′-O-β-葡萄糖苷等可增强甜味，但这些物质在PFM阶段含量无明显变化，无法完全解释甜味提升现象。

在酿酒学领域，非靶向分析常用于描述性研究，可根据特定参数（如地理来源、葡萄成熟度、特定酿酒工艺或同一葡萄品种的基因突变）对样品进行区分。迄今为止，大多数关于味觉活性化合物的研究都基于靶向分析方法。然而，增甜分子来自不同化学家族，结构各异，因此难以仅凭化学结构筛选出味觉活性化合物。近年来，非靶向分析已被用于发现白兰地中的新型味觉活性物质。目前，代谢组学被认为是研究发酵后浸渍引发葡萄酒化学变化、鉴定新型甜味化合物的适宜方法。

 

结果与讨论

2.1.样品和试剂

代谢组学样品：2019年份（5个产区，93个发酵罐）、2020年份（8个产区，106个发酵罐），分别在酒精发酵结束（AF）和发酵后浸渍（PFM）结束取样。每个庄园和年份的采样大桶数量列于表1。

NSA定量：96款（85红+11白），涵盖法国多产区及阿根廷红葡萄酒，年份1961-2020。

温度实验样品（为监测发酵后浸渍过程中NSA的演变）：3组实验（A/B/C），每组2个发酵罐（相同葡萄），温度分别为25/30℃、26/30℃、33/35℃。

 

 

2.2.UHPLC-HRMS及HRMS/MS分析

 

2.3.质谱数据处理

 

2.4.NMR分析

 

2.5.多变量数据分析（MVDA）

 

2.6.定向隔离协议

 

2.7.感官分析

 

2.8.葡萄酒中纯化化合物的定量

 

结果与讨论

 

3.1.非靶向代谢组学分析发酵后浸渍对红葡萄酒非挥发性成分的影响

2019年份葡萄酒在负离子模式下检测到11,600个特征峰，正离子模式下检测到6,053个特征峰，2020年份葡萄酒在负离子模式下检测到18,583个特征峰，正离子模式下检测到21,196个特征峰。特征峰数量存在差异，部分原因是第一步数据处理中使用的筛选条件不同。经最终筛选（仅保留具有二级质谱图谱的化合物），2019年份和2020年份葡萄酒在负离子模式下分别保留9,771个和9,023个特征峰，正离子模式下分别保留5,433个和8,097个特征峰，后续研究均基于这些数据展开。

为明确该酿酒步骤的影响，针对每个年份、每种离子化模式下的所有样品数据集，基于两种状态（酒精发酵结束和发酵后浸渍结束）进行PCA分析（图1）。两个因子轴对不同图谱数据的解释度在9.1%~15.5%之间，与数据集规模相符。主成分分析结果揭示了两种状态之间的差异，且正离子模式下的聚类现象更显著，表明正离子模式下检测到的差异比负离子模式更明显，尤其是2020年份葡萄酒。

 

 

随后通过方差分析进一步探究发酵后浸渍引发的差异，仅纳入在酿酒两个阶段均采集到样品的发酵罐（2019年份79个，2020年份89个）。结果显示，2019年份和2020年份葡萄酒在负离子模式下分别筛选出585个和499个差异特征峰，正离子模式下分别筛选出644个和270个差异特征峰。这些化合物在酒精发酵结束和发酵后浸渍结束时的含量存在显著差异（p<0.05），占所有具有二级质谱图谱特征峰的3.3%~11.9%。特征峰被分为两类：发酵后浸渍过程中含量增加的化合物和含量减少的化合物。其中，负离子模式下2019年份和2020年份分别有244个和316个特征峰含量增加；正离子模式下2019年份和2020年份分别有344个和162个特征峰含量增加。总体而言，因酿酒步骤不同而含量存在差异的特征峰中，55%在发酵后浸渍过程中含量增加。

 

3.2.筛选发酵后浸渍过程中含量增加的化合物

为筛选可能解释酵母自溶（与发酵后浸渍相伴发生）过程中葡萄酒甜味增强的候选化合物，后续研究聚焦于发酵后浸渍过程中含量增加的特征峰。通过计算每个发酵罐中该特征峰在发酵后浸渍结束时的平均峰面积与酒精发酵结束时的平均峰面积之差，获得每个特征峰的增加指数。此外，对比2019年份和2020年份的数据，筛选出两种年份、每种离子化模式下发酵后浸渍过程中均含量增加的特征峰。结果显示，负离子模式下有33个特征峰在两个年份中均增加，正离子模式下有32个特征峰在两个年份中均增加。最后，对比这两个列表，筛选出在两种离子化模式下检测到的对应同一化合物的特征峰，最终得到17个候选化合物，用于进一步探究可能的增甜相关离子（表2）。在这17个特征峰中，部分通过与文献数据对比进行推定注释，包括黄烷-3-醇类化合物、香豆酸、花旗松素和柚皮素，置信度为2级（表2）。这些化合物的含量较酒精发酵结束时的初始含量增加了14.6%~80.1%。通过SIRIUS软件分析二级质谱图谱，推定鉴定出亮氨酰亮氨酸、二氢杨梅素和N6-琥珀酰腺苷，置信度为3级，这些化合物尚未在葡萄酒中被明确鉴定。关于它们的味觉特性，亮氨酰亮氨酸被描述为一种苦味化合物，而二氢杨梅素和N6-琥珀酰腺苷的味觉特性尚未明确。

 

 

为筛选出候选化合物，研究设定了两项标准：一是在PFM过程中含量显著增加，二是在葡萄酒中具有较高的信号强度（更可能具备味觉贡献潜力）。对列表中的化合物进行优先级排序以简化筛选流程：先分别根据“增加指数”（PFM与酒精发酵结束时的峰面积差）和“PFM样品中的平均峰面积”对化合物排序，再通过“两项排名相乘后重新转换为综合排名”的方式，赋予每个化合物“全局排名”（表2）。正离子化模式（PI）下质荷比（m/z）为384的离子（推定鉴定为N6-琥珀酰腺苷）在全局排名中位列第一，该离子平均含量增加107.8%，平均峰面积达1.19×108，处于所有化合物平均峰面积列表的前25%。

图2展示了不同年份、不同离子化模式下该离子的增加指数：2020年份葡萄酒中，PFM过程中m/z 384离子的含量增至酒精发酵结束（AF）时初始含量的2倍以上，其中正离子化模式（PI）和负离子化模式（NI）下的增幅分别为123%和163%；2019年份葡萄酒中该离子含量同样显著增加，负离子化模式（NI）和正离子化模式（PI）下的增幅分别为70%和75%。全局排名2至7位的其他离子均被注释为苦味化合物，而最后6种尚未明确鉴定及味觉属性的化合物排名靠后，因此未被选为目标化合物。综上，m/z 384离子符合两项筛选标准，被确定为目标化合物，需对其进行纯化以解析分子结构并评估感官属性。

 

 

3.3.与m/z 384相关的目标化合物分离与鉴定

由于分离得到的化合物量较少，无法组织大规模品鉴panel，因此由6位葡萄酒品鉴专家进行感官分析。为接近该化合物在葡萄酒中的预估浓度，研究将其配制成5 mg/L的水-乙醇溶液，并与未添加该化合物的空白对照溶液对比，重点评估甜度、苦味和酸味。感官分析结果基于品鉴专家的共识得出：两种溶液均未检测出苦味或酸味，添加目标化合物的溶液被所有专家一致感知为甜味（强度为4级，满分5级），而空白对照溶液无甜味。这些结果证实了该分子的研究价值，但要明确其对葡萄酒味觉的实际影响，仍需开展更全面的感官表征实验。

目标化合物在正离子化模式（PI）下的高分辨质谱（HRMS）图谱显示，主离子峰m/z为384.1149，对应质子化离子[M+H]⁺，由此推定其经验分子式为C₁₄H₁₇N₅O₈（误差0.2 ppm），不饱和度为9。通过SIRIUS软件分析光谱数据，推测该m/z 384.1149离子的结构为N6-琥珀酰腺苷（图3）。为进一步确认结构，研究购买了N6-琥珀酰腺苷标准品进行核磁共振对比。由于分离得到的化合物因甲酸残留纯度不足，研究将分离化合物与标准品均溶解于540 μL磷酸盐缓冲液和60 μL重水（D₂O）中，以最小化pH差异导致的化学位移变化。在此条件下，分离化合物与标准品的核磁共振信号完全吻合，证实分离化合物为N6-琥珀酰腺苷。

 

 

3.4.N6-琥珀酰腺苷（NSA）标准品的味觉表征

NSA标准品的获取为感官分析提供了支持，可进一步验证分离化合物的味觉属性。但由于标准品数量有限，仍无法开展大规模品鉴实验，因此感官分析条件与分离化合物一致：5 mg/L的NSA标准品水-乙醇溶液同样被感知为甜味（强度4级，满分5级），与分离化合物结果完全一致，首次证实该分子的甜味属性。此外，5 mg/L浓度下的NSA甜味具有可感知性。作为对比，文献显示葡萄糖和果糖在水中的味觉检出阈值为g/L级。然而，葡萄酒中氨基酸浓度通常低于100 mg/L，香槟中核苷浓度低于1 mg/L，这些化合物的浓度与其味觉检出阈值的对比结果显示，无法确定它们对葡萄酒甜味的实际贡献。因此，要确认NSA的甜味属性及对葡萄酒味觉的影响，需进一步开展更多品鉴实验，并测定其味觉检出阈值。

 

3.5.商业葡萄酒中NSA的靶向定量分析及PFM过程中的释放规律

3.5.1.方法验证

研究以商业红葡萄酒为基质构建校准曲线，开发了NSA定量方法以规避基质效应，并通过灵敏度、线性、特异性、重复性和准确度评估验证方法有效性：

检出限（LOD）为2.5 μg/L，定量限（LOQ）为5 μg/L；

线性范围为5 μg/L~10 mg/L，覆盖葡萄酒样品稀释后的常见浓度；

对比多种回归模型后，选择F检验p值最低、残差标准误差最小且决定系数最高的模型，通过峰面积与理论浓度的关系得到二次校准曲线，决定系数（R²）达0.999；

特异性：每个样品的质子化离子质量测定误差≤0.55 ppm，保留时间波动≤0.08 min；

重复性：各浓度水平下变异系数（CV）<8.7%；

准确度：对两款红葡萄酒和一款白葡萄酒进行3个浓度水平的加标实验，回收率为92%~108%，符合行业标准。

 

3.5.2.商业葡萄酒中NSA的定量结果

研究采用该定量方法，对96款不同产区、不同品种的商业葡萄酒进行NSA含量测定：

红葡萄酒（n=85）中NSA平均浓度为3.16 mg/L，浓度范围为0.35±0.02~8.76±0.61 mg/L；

白葡萄酒（n=11）中NSA平均浓度为2 mg/L，浓度范围为0.76±0.05~3.05±0.21 mg/L。

由于置信区间重叠且白葡萄酒样品量较少，无法判定红葡萄酒中NSA浓度显著高于白葡萄酒。此前感官实验显示，5 mg/L的NSA水-乙醇溶液甜味强度为4级（满分5级），而商业葡萄酒中NSA平均浓度低于5 mg/L。因此，NSA可能对葡萄酒甜味有贡献，但需进一步测定其味觉检出阈值，以验证该假设并明确其感官属性。

 

3.6.发酵后浸渍（PFM）过程中NSA释放规律的研究

研究通过实验监测了发酵后浸渍（PFM）过程中NSA含量的变化（图4）。结果显示，从酒精发酵结束（AF）到PFM结束，NSA含量呈动态上升趋势。Spearman相关性检验证实，采样天数与NSA浓度呈显著正相关（p<0.05），这与代谢组学分析中“两种状态（AF与PFM）下NSA含量增加”的结果一致。

此外，每个实验均在两个不同温度条件下进行，发酵罐中装入相同葡萄原料。结果表明，浸渍温度越高，葡萄酒中NSA浓度越高：Wilcoxon-Mann-Whitney检验显示，实验A（p=0.030）和实验B（p=0.036）中温度对NSA浓度的影响在5%显著性水平下显著，实验C（p=0.059）接近显著水平。具体来看，浸渍温度对NSA浓度具有显著影响：

实验A中，浸渍第5天开始出现浓度差异，PFM结束时，25℃条件下NSA浓度为3.49±0.24 mg/L，30℃条件下为3.78±0.26 mg/L；

实验B中，浸渍11天后差异更明显，26℃条件下浓度为2.06±0.14 mg/L，30℃条件下为2.64±0.18 mg/L；

实验C中，PFM结束时，33℃条件下NSA浓度为3.04±0.21 mg/L，35℃条件下为4.14±0.29 mg/L。

NSA的来源可能有两个：葡萄固体部分或酵母自溶。商业葡萄酒定量分析显示，葡萄品种对NSA含量无显著影响（白葡萄酒中同样检测到NSA）；此外，PFM过程中NSA含量的增加与酵母自溶过程同步。从化学结构来看，NSA由核苷（腺苷）和琥珀酸酯两部分组成。由于琥珀酸属于发酵源性有机酸，推测NSA可能由酵母间接产生。关于葡萄酒中NSA的具体来源，仍需进一步研究证实。

 

 

研究结论

 

本研究旨在鉴定发酵后浸渍（PFM）过程中含量增加的新型味觉活性化合物。研究采用代谢组学分析方法，首先建立非靶向超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）方法获取大量数据，随后通过多项统计分析，筛选出162~357个在浸渍过程中含量增加的质谱特征峰。其中17种化合物在所有分析批次中均稳定存在，研究进一步根据其增幅、推定丰度及在葡萄酒中的潜在新颖性进行优先级排序，最终锁定质荷比（m/z）为384的化合物。通过多步分离纯化流程，研究成功分离该化合物并解析其结构，明确其为N6-琥珀酰腺苷（NSA），这是首次在葡萄酒中对该化合物进行明确鉴定。随后，研究建立并验证了适用于红白葡萄酒的NSA定量方法：红葡萄酒中NSA平均浓度为3.16 mg/L，白葡萄酒中为2 mg/L。此外，感官分析证实，5 mg/L的NSA水-乙醇溶液具有明显甜味。

多个酒庄的实验证实，PFM过程中NSA含量显著增加，因此推测其可能是红葡萄酒酿造关键步骤（涉及酵母自溶）中甜味增强的原因之一。未来需进一步研究各类酿酒参数（尤其是浸渍时间和温度）对NSA的影响，以明确其调控机制并提供酿酒工艺优化建议。同时，NSA的具体来源以及未经过PFM的白葡萄酒中NSA的存在原因，仍需深入探究。