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Food Chem：通过自上而下的肽组学鉴定完整肽段，揭示了热不稳定葡萄酒蛋白中的切割位点
发布时间：
2026-03-18
来源：
葡萄研究
通过自上而下的肽组学鉴定完整肽段，揭示了热不稳定葡萄酒蛋白中的切割位点
期刊：Food Chemistry（9.8）
发表日期：2021年11月
研究摘要
防止葡萄酒中雾浊的形成对酿酒师而言是一项挑战。葡萄酒中的热不稳定蛋白（尤其是类甜蛋白，TLPs；几丁质酶，CHIs）在不同理化条件下会发生结构变化，导致蛋白质聚集，最终使瓶装产品出现可见雾浊。肽酶是一种替代澄清方法，但在典型酿酒条件（酸性pH值和低温）下难以实现有效的蛋白水解。本研究中，在蛋白质表面易断裂键暴露后，通过基于质谱的肽组学（自上而下蛋白质组学）鉴定出了TLPs和CHIs的胰蛋白酶解肽段。根据有限蛋白水解理论，温度和pH值变化引发的蛋白质构象变化，使得酶可及区域得以检测。通过蛋白质结构可视化和分子动力学模拟明确了切割位点，并为雾浊形成机制提供了科学依据。该方法为筛选预防葡萄酒雾浊的理想酶提供了工具。
研究背景
瓶装葡萄酒中的蛋白质雾浊主要由运输和储存过程中的不当温度条件引发，导致消费者拒收该产品。热不稳定蛋白（HUPs），即类甜蛋白（TLPs）和几丁质酶（CHIs）通过酚-蛋白相互作用形成的分子桥或二硫键发生交联反应，最终形成不溶性雾浊颗粒。温度和pH值的变化会改变蛋白疏水核心的暴露程度，进而诱导蛋白-蛋白相互作用。目前预防葡萄酒雾浊最先进的技术是使用膨润土，但有研究表明，膨润土会对葡萄酒的感官特性产生有害影响，且会减少最终产品的体积。由于雾浊的形成源于蛋白质的聚集和沉淀，蛋白水解酶（肽酶）可作为传统澄清剂的替代方案，但典型的酿酒条件（强酸性pH值、低温，以及乙醇、SO2和多酚等酶抑制化合物的存在）仍难以克服。“有限蛋白水解”理论提出蛋白水解酶仅能作用于蛋白质的部分关键区域（如环区和不规则结构）。在轻微的温度和pH值变化下，蛋白质表面的易断裂键会逐渐暴露，产生可检测的特异性切割产物。构象变化会使具有黏性的疏水氨基酸暴露在蛋白质表面，进而引发不同模式的聚集。此外，这些修饰还会导致蛋白质分子内波动与柔性变化，可能影响蛋白质对酶解的敏感性。
目前，葡萄酒中TLPs和CHIs的内部切割位点尚未见报道，且对其降解产物的分析仍局限于色谱或电泳方法。近年来，质谱（MS）仪器的改进催生了可预测蛋白质天然构象的分析技术。自上而下质谱策略（Top-down MS）无需任何初步化学处理，可直接分析完整蛋白质和肽段，为蛋白质的深入结构表征提供全面数据。
本研究提出一种在天然和变性条件下，将自上而下肽组学与“有限蛋白水解”理论相结合的方法，旨在鉴定并定位蛋白水解产生的片段，并将其与雾浊形成的分子机制相关联。通过鉴定葡萄酒蛋白胰蛋白酶解产生的完整肽段，结合后续的分子动力学模拟，为深入探讨雾浊相关的蛋白-蛋白相互作用机制提供依据。
结果与讨论
2.1.葡萄酒中高含蛋白胶体的技术规模分离
250 L Silvaner Franken白葡萄酒（热测试浊度差 > 50 NTU），超滤（10 kDa MWCO）浓缩，冻干获得含蛋白胶体。
2.2.通过糖测定和蛋白质和氨基酸定量分析胶体和葡萄酒蛋白溶液
蛋白：Bradford法；糖：HPAEC-PAD；氨基酸：氨基酸分析仪。
2.3.分光光度法的热测试和雾度测量
热测试（80℃加热3 h→5℃冷却16 h→室温），540 nm吸光度测定。
2.4.自上而下的肽组学
3种pH（3、5、7）、2种温度处理（天然37℃、变性75℃-复性37℃），胰蛋白酶酶解，阴性对照（无胰蛋白酶）。
2.5.TLP和CHI结构模型的制备
2.6.分子动力学模拟
结果与讨论
3.1.分子变化对雾浊形成的影响
为探究葡萄酒蛋白中雾浊的形成及肽酶介导的切割位点，本研究从白葡萄酒中分离出含蛋白胶体，经热测试、胰蛋白酶解及后续质谱分析进行进一步处理。通过设置3种不同pH值和1种热预处理，构建4种实验条件，分析蛋白水解对雾浊形成的影响。图1A展示了热测试后各样品的外观特征。
pH影响：pH5时雾浊最显著，pH3和pH5（胰蛋白酶失活）雾浊减少率可忽略（<6%），pH7天然条件下雾浊减少38.8%，pH7+75℃预变性后雾浊减少67.4%（图1B）。
肽段与雾浊相关性：雾浊减少量与检测到的肽段数量呈正相关（图1B-C），表明所有葡萄酒蛋白均可能参与聚集体形成，且TLP和CHI通过分子“桥”构建了相互关联的网络。
3.2.类甜蛋白（TLP）和几丁质酶（CHI）的分子动力学（MD）模拟
将天然状态（37℃、pH7）下TLP和CHI的结构模型，与变性状态（75℃、pH7）及变性-复性状态（75℃→37℃、pH7）的模型进行对比，以鉴定各蛋白链中易被水解的暴露区域。如图2A所示，TLP结构分为三个结构域，并在三种不同条件下进行模拟。变性后，结构域II中的部分α-螺旋基序（α2、α3、α4和α5部分螺旋）消失，导致蛋白表面暴露未折叠区域；结构域I中观察到β13折叠链变性，且β7和β8折叠链缩短（图2A），结构域
图2B展示了三种条件下CHI的结构模型。由于缺乏晶体结构，二级结构根据CHI的氨基酸序列进行标注（图2C）。75℃加热后，α1和α3螺旋基序解折叠，环区暴露于蛋白表面，同时观察到CHI的N端区域发生完全重排，属于不可逆构象变化。
如图3及补充视频1和2所示，蛋白表面也出现不可逆变性：TLP模型在变性和复性过程中未受到严重影响（可逆折叠），而CHI模型的表面积增大（图3），导致蛋白结构域暴露，其中包括α3螺旋中的易断裂区域。这些切割区域通过肽组学分析得到了验证（图2C）。
3.3.完整肽段鉴定与切割位点分析
变性条件下共鉴定到56种不同蛋白来源的肽段，而天然状态下仅鉴定到10种（图1C）；pH3条件下也鉴定到2种肽段。一种推定TLP（ID：Q9M4G6）和IV类CHI（ID：Q7XAU6；B0FZ27）在变性和天然状态下均被检测到，而另一种TLP（ID：Q7XAU7）仅在样品预先加热后被发现。
对于TLP：天然状态（37℃）下检测到推定TLP（ID：Q9M4G6）来源的肽段LDSGQSWTITVNPGTTNAR；水解前经变性处理后，TLP（ID：Q9M4G6）释放出两种肽段（LDSGQSWTITVNPGTTNAR和TVWAAASPGGGR），另一种TLP（ID：Q7XAU7）释放出四种肽段（LGSGQSWSLNVNAGTTGGR、AAAVPGGGMQLGSGQSWSLNVNAGTTGGR、TNCNFDASGNGK、TRCPDAYSYPK）。
对于CHI（ID：Q7XAU6和B0FZ27）：天然状态下酶解后检测到两种肽段（AAFLSALNSYSGFGNDGSTDANK和AINGAVECNGGNTAAVNAR）；预先变性处理新增3种肽段（FFDGIINQAASSCAGK、WNYNYGAAGNSIGFNGLSNPGIVATDVVTSFK和NNVHSVIGQGFGATIR）的释放（表1）。
3.4.无标记肽段定量
定量分析仅选用天然状态（37℃、pH7）和变性-复性状态（75→37℃、pH7）下均检测到的肽段，且每种热不稳定蛋白（HUP）仅选取一种肽段。比较这两种实验条件下肽段的离子强度，基于信号强度和峰面积积分估算肽段的相对丰度（图4）。结果显示，所有情况下，样品预先变性后，TLP和CHI来源肽段的计算峰面积和峰高均更高。
研究结论
质谱与分子动力学模拟相结合，揭示了不稳定葡萄酒蛋白中的切割位点，打破了“结构刚性是酿酒条件下这些蛋白不被肽酶切割的主要原因”的认知。实验证实酿酒过程中典型的酸性条件（pH 3-5）才是阻碍肽酶与底物蛋白相互作用的关键因素。在pH 7条件下，即使未经过预热处理，TLPs和CHIs仍能被有效切割，雾浊形成显著减少38.8%，而pH 3和pH 5时雾浊减少量可忽略不计，进一步佐证了酸性环境对酶解的抑制作用。这一结果与“有限蛋白水解理论”高度契合，该理论认为肽酶仅能作用于蛋白表面暴露的环区、末端及不规则结构，而pH和温度的调制会破坏蛋白的氢键网络，导致三级结构不可逆变化，使原本隐藏的切割位点暴露，提升酶对底物的可及性。实验中也观察到，75℃预变性处理后，蛋白结构的不可逆变化进一步增加了易被切割的暴露区域，使雾浊减少率提升至67.4%，且切割肽段的数量和长度均显著优于天然条件。此外，研究还明确了两类致浊蛋白的关键切割靶点：TLP结构中由8个二硫键维持稳定，其中位于结构域III暴露环区的Cys74-Cys84二硫键和结构域II的Cys146-Cys196二硫键所在肽段被切割后，可减少蛋白分子间的交联位点；CHI的5个二硫键中，Cys83与Cys232相关的肽段切割同样能削弱其聚集潜力，这些靶点的明确为后续筛选针对性肽酶提供了重要依据，而所有葡萄酒蛋白均可能通过分子“桥”参与聚集体形成的发现，也进一步完善了葡萄酒雾浊形成的分子机制。
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