Nature Communications最新报道：在酿酒酵母菌中从头合成美白明星分子——光甘草定

一．研究摘要

      黄酮类化合物的多样性源于少数前体被特定酶修饰，然而其进化代谢网络的复杂性使代谢途径阐明和设计变得复杂。本研究通过结合染色体水平基因组组装与大规模转录组分析，他们在酵母中鉴定并重建了光甘草定生物合成途径，从而实现了从光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）中这种抗氧化黄酮类化合物的从头生产。通过分析183个甘草转录组，他们发现了四类能够修饰异黄烷骨架的酶。在13条理论途径中，他们验证了6条功能途径，揭示了一个梯状、多途径修饰网络。该网络具有多步“保护–去保护”机制，由动态甲基化–去甲基化循环驱动，该循环调节中间体的亲水性和酶亲和力，从而实现物种特异性的光甘草定合成。在酵母中重建该网络显示，代谢冗余和互连性相比单途径设计增强了稳健性和产量。这些结果建立了具有广泛含义的生物合成范式，用于天然产物发现和生物制造。

二．研究背景

      在黄酮类化合物生物合成领域，超过9,000种不同的化合物从有限的共享前体进化而来，使黄酮类成为化学多样性最丰富的天然产物家族之一。这种惊人的多样性主要由下游核心骨架组装的修饰酶驱动，这些酶引入上下文依赖的修饰，如甲基化、羟基化、糖基化和环化。这些后组装转化对化合物的生物活性、溶解度、稳定性和亚细胞定位至关重要。这种后组装过程不仅对生成多样化的天然产物至关重要，还增加了最终塑造这些化合物生物活性的额外调控层。

      然而，这种修饰复杂性在试图重建或工程特定目标化合物的生物合成时构成挑战。由于酶的广谱性导致的反应序列复杂，常常产生代谢网络——每个步骤相互交织且高度上下文依赖。这种复杂性使得完全阐明具有多个可修饰位点和模糊修饰逻辑的特化代谢物生物合成途径特别困难。一个显著例子是光甘草定，一种天然存在的异戊烯基异黄酮。它以美白、抗炎和抗衰老特性闻名，在高端护肤化妆品中占有数百万美元的全球市场。目前，光甘草定的全球供应链依赖从光果甘草根部提取和纯化，根干重产量仅为0.08–0.35%，导致沙漠化和环境退化。同时，由于立体选择性构建C-3手性中心和共轭体系化学选择性还原的挑战，光甘草定难以化学合成。微生物生物合成代表一种有前景的可持续替代方案；然而，尽管光甘草定于1976年从甘草中分离，其在光果甘草中的天然生物合成途径仍未完全阐明。

      在本研究中，他们应用整合实验代谢数据的代谢途径搜索算法，全面阐明并绘制了光甘草定的迷宫般生物合成网络。通过利用高质量基因组组装结合广泛的转录组数据集，他们鉴定了所有参与光甘草定生物合成的关键修饰酶。这些酶随后用于重建多途径合成途径，其中一组广谱酶支持多个平行生物合成路线。通过这种重建，他们揭示了光甘草定形成的不同生物合成模式，并最终在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中实现了光甘草定的从头生物合成，为传统植物提取的可持续替代方案和野生植物种群保护铺平道路。

三．研究结果

（1）光甘草定途径设计和核心节点鉴定

      为发现光甘草定的生物合成途径，他们采用基于已知酶促反应的代谢途径搜索算法，结合源于反应规则的逆合成算法，通过逐步解构光甘草定至内源酵母代谢物，实现系统性途径设计。基于反应规则的途径搜索旨在枚举所有由已知酶反应类型支持的生化可行路线，包括可能代表甘草中生物合成路线的途径以及甘草实际可能不使用的其他途径。为聚焦于与甘草相关的路线，进一步通过仅保留在甘草中检测到的中间体来精炼网络（图1a）。使用此精选化合物-转化网络，他们构建有向图并进行系统深度优先遍历，鉴定出13条潜在生物合成途径，导致光甘草定产生，涉及L-苯丙氨酸作为前体和21个中间代谢物（图1a）。其中，9个化合物位于途径分支节点，超过69%的预测途径包括超过四个分支节点。这种多样化和众多分支点的存在显著增加了光甘草定生物合成的复杂性。有趣的是，这种复杂性由动态甲基化–去甲基化和二氢呋喃环化–去环化进程主导，其中去甲基化和去环化的顺序似乎引导代谢通量通过不同的生物合成路线。

      为评估预测中的可行生物合成路线，他们对三种甘草物种进行了代谢组学分析：光果甘草、乌拉尔甘草（G. uralensis）和胀果甘草（G. inflata）（图1a-b）。代谢组学分析显示，主要代谢物——化合物5、11、13、15和20——主要在根部积累相比叶和茎。光甘草定仅在光果甘草中丰富检测到，而在胀果甘草中水平较低。此外，几条预测中间体（4、8、9、10、12和14）也在光果甘草中鉴定，提供其作为关键代谢网络节点的支持。因此，通过以节点为中心的代谢组学数据分析，预测路线主要整合关键中间体，如紫檀苷。为应对这种复杂性，他们重点将光甘草定生物合成中的未解决步骤分类为四类主要修饰反应：蝶啶还原、异戊烯基化、异戊烯基环化和去甲基化（图1c），分别可能由蝶啶还原酶（PTRs）、异戊烯基转移酶（PTs）、氧化环化酶（OCs）和去甲基酶（DMTs）介导。PTRs、PTs和OCs酶具有扩展中间代谢物范围的潜力。此外，DMTs催化关键分支形成反应，引导代谢通量向不同结果。四种修饰反应可以通过不同顺序通过各种分支节点进行，最终产生光甘草定（图1a）。

图1. 光甘草定途径设计和核心节点鉴定

（2）系统组学分析用于酶发现

      为实现系统鉴定光甘草定生物合成底层基因组，他们首先生成光果甘草的高质量染色体水平基因组组装作为基础资源（图2a）。野生光果甘草植株从中国西北自然栖息地采集用于基因组测序。组装基因组跨度415 Mb，并在染色体水平组织，注释预测34,941个高置信蛋白编码基因。该基因组组装连同广泛的季节性和器官特异性转录组数据集，使整合基因组挖掘和共表达分析成为可能，以鉴定参与光甘草定生物合成的候选酶（图2）。使用直系同源基因分组，他们构建了光果甘草与胀果甘草、乌拉尔甘草和其他豆科相关物种的系统发育树。分析显示光果甘草与胀果甘草进化关系最近。基于此，他们进行了系统全基因组注释，特别关注候选修饰基因。其中，PTRs连同VRs和IFRs，是NADPH依赖还原酶，具有相似催化机制和高序列相似性，并通过系统发育分析进行功能注释。

      为调查参与光甘草定生物合成的基因转录模式，他们进行了大规模转录组学研究。他们对五个主要甘草物种采样，跨越七个地点、四个关键生长时期和不同器官，共183个独特样本。聚类分析显示器官特异性转录组轮廓主要分为三簇：1) 主根和横根，2) 茎和芽，3) 叶。相比之下，物种间整体转录组差异相对较小，仅在某些特定基因中观察到变异。候选基因通过多层筛选策略鉴定，结合基于序列的功能注释，随后使用系统发育聚类和保守基序分析精炼。此整合过程产生7个PTRs、18个PTs、39个OCs和6个DMTs用于下游分析。这些基因表现出染色体聚类，主要位于染色体5和6（图2b）。

      为进一步鉴定参与光甘草定合成的基因，他们进行层次聚类以生成跨五器官的转录物共表达模式。聚类揭示了一个根富集基因表达簇，包括1个PTR、9个PTs、8个OCs和2个DMTs（图2c）。为精炼候选基因，他们使用先前报道的关键基因GgI2'H1作为诱饵进行共表达分析。此分析优先候选酶，包括1个PTR、7个PTs、2个OCs和2个DMTs（表1）。

图2. 系统组学分析挖掘关键酶

 

（3）光甘草定生物合成关键酶的逐步表征

        为表征光甘草定途径中的初始修饰酶，他们重点关注蝶啶还原酶（PTR），其催化潜在核心骨架紫檀苷和去甲基紫檀苷内二氢呋喃环的还原裂解（图3）。他们测试了一个通过共表达分析鉴定的PTR候选GgPTR1。该酶将紫檀苷和去甲基紫檀苷转化为vestitol和去甲基vestitol，转化率分别为90.6±3.6%和52.7±0.9%（图3a）。这证实共表达分析是优先候选酶的有效策略。为鉴定更高效的PTRs，他们进一步评估了剩余6个PTR基因。其中，同源物GgPTR5显示可检测活性但远弱于GgPTR1。由于其与GgPTR1的序列相似性，他们尝试通过在其底物结合袋引入氨基酸替换来改善GgPTR5。尽管这些突变产生轻微活性增加，但均无法使GgPTR5接近GgPTR1的活性。分子动力学模拟进一步揭示GgPTR5中底物结合不稳定，表明其低活性源于整体结构限制而非单个残基缺陷（补充图4c-d）。值得注意的是，GgPTR2具有不同转录模式——在茎和叶中高表达——也表现出活性，对紫檀苷和去甲基紫檀苷的转化率分别为58.8±7.6%和4.7±2.5%（图3a）。此外，尽管与GgPTR1共享71%序列相似性，GgPTR2可将licoagrocarpin转化为4'-O-甲基preglabridin，而GgPTR1无活性，表明GgPTR2对异戊烯基底物的选择性识别（图3b）。为进一步验证其活性，他们对GgPTR1和GgPTR2进行了体外测定。两种酶均对各自底物显示清晰催化活性。这些结果与体内酵母测定一致，进一步证实两种酶的功能。为进一步探索功能分化，他们模拟了其与紫檀苷和licoagrocarpin的复合物结构（图3c）。静电势图表明两种酶均具有带正电的催化袋，吸引底物的带负电酚羟基。此外，GgPTR2对8和20表现出相似结合取向，与GgPTR1中8的结合一致。相反，化合物20在GgPTR1中采用180度翻转取向，这可能解释其缺乏对该底物的催化活性（图3c）。

      接下来，为鉴定光果甘草中作用于异黄烷底物的异戊烯基转移酶，他们测试了七个PT候选，发现GgPT1表现出可检测活性，催化化合物9和13转化为4'-O-甲基preglabridin和preglabridin（图3d）。其他PT基因，尽管与GgPT1具有一定系统发育相似性，对测试底物无催化活性（图3d）。氨基酸比较显示GgPT1含有七个其他GgPTs中缺失的独特残基，突变分析证明K242对其催化活性必需。此外，他们测试了所有七个GgPTs对化合物8的活性，发现均无法催化其转化为化合物20。相反，先前报道的酶PcM4DT能够催化从8到20的反应。

      在特异性异戊烯基化后，需要分子内环化以形成二氢苯并吡喃部分。先前报道的催化异戊烯基异黄酮氧化环化的酶属于细胞色素P450家族，如CYP71D8和CYP82A2。共表达分析导致鉴定两个候选基因，GgOC1和GgOC2。有趣的是，GgOC1表现出不对称共表达模式：OC的表达与上游基因（即GgI2'H1）的转录活性相关，而上游基因与OC表达的相关性相对较弱。这强烈表明GgOC1最可能参与光甘草定生物合成。事实上，对两个OCs的功能测定显示仅GgOC1催化4'-O-甲基preglabridin或preglabridin的氧化环化，产生4'-O-甲基光甘草定或光甘草定（图3e）。此外，他们测试了GgOC3和其他几个BBE样酶，发现它们也无活性。为调查其无活性的原因，他们进行了突变分析，显示GgOC1的残基I293和T295对催化必需，解释了GgOC2和GgOC3的活性丧失。GgOC1的催化活性使用酵母微粒体体外进一步验证，结果与体内酵母测定一致，证实GgOC1的功能。进一步分析显示GgOC1属于伯伯林桥酶家族，并在系统发育树中与先前报道的负责异戊烯基查尔酮氧化环化的MaOC1聚类。

      迄今为止，植物中尚未报道催化异黄酮去甲基化的DMTs。为在甘草中找到DMTs，他们将GgDMT1鉴定为共表达分析中第二位候选。它编码2-酮戊二酸依赖双加氧酶，并显示完全实现化合物11去甲基化的能力（图3f）。有趣的是，在检查底物谱时，他们发现GgDMT1显示高广谱性，并高效去甲基化vestitol和4'-O-甲基preglabridin。它对甲氧基甲酰净显示中等活性，但对紫檀苷显示非常弱（图3f）。GgDMT1的活性使用纯化蛋白体外进一步证实。此外，GgDMT2无可检测活性。对接分析表明GgDMT2在活性位点中底物取向错误，损害生产性催化。同样，在影响底物定位的残基N303（N303R）改变GgDMT1也废除其活性。为进一步扩展特异性4'-O-去甲基化的酶工具箱，他们筛选了一组先前报道的去甲基酶，包括来自植物、真菌和人类的细胞色素P450酶。其中，仅真菌酶NhPDA1显示去甲基化活性，对多个4'-O-甲基化底物（5、8、9、10和11）显示广谱性（图3f）。这些观察与先前报道的去甲基酶通常表现出宽底物特异性一致。

         鉴于源自光果甘草的GgDMT1表现出强底物广谱性和高催化活性，这引发了为什么甲基化中间体仍在此物种中积累的问题。季节性转录模式分析显示O-甲基转移酶和去甲基酶表达呈相反趋势，表明前体合成和最终产物积累可能发生在时间上不同的阶段。此外，亚细胞定位研究显示GgDMT1为细胞质，而GgOC1和GgPT1与Sec61-mNeonGreen共定位，表明两种酶定位于内质网（图3g）。这种空间分离暗示四种修饰酶可能被区室化——潜在地在特定细胞器内——从而促进中间体分离和生物合成途径的逐步调控。

    此外，他们发现整个途径中，甲基化先发生，随后去甲基化。这引发另一个问题：这种复杂性是否对途径必需。当他们检查绕过甲基化反应的替代路线时，发现I2'H1-IFR1-VR1模块能够催化从中间体4到12的转化。然而，其催化效率极低。分子动力学模拟显示17与VR结合比7更不稳定。这些结果表明甲基化修饰有效阻碍非甲基化路线（P2-P4），然后引导代谢通量向高效甲基化途径（P5-P13）。

       有趣的是，当他们分析这些关键酶在其他两个甘草物种中的存在时，发现两者均含有蛋白序列同源性>93%的同源基因，其基因组位点相对保守（图3h）。他们还分析了三种物种中四个关键酶的转录差异，发现光果甘草中PT的转录水平显著高于其他两个物种。PTR、OC和DMT在光果甘草中也显示显著高于胀果甘草的转录水平（图3i）。这些发现有助于解释他们的代谢组学分析中观察到的光甘草定在光果甘草中的积累（图1b）。

图3. 光甘草定生物合成关键酶的表征

（4）在工程酵母中光甘草定的从头生物合成

      为实现酵母中从葡萄糖生物合成光甘草定，他们设计了两个模块的途径，核心骨架模块（葡萄糖到8）和修饰模块（8到15）（图4a）。他们首先使用表征酶组装修饰模块。鉴于所有涉及酶——包括PTR、PT、OC和DMT——表现出宽底物广谱性，他们从化合物8到15重建代谢景观，并发现了一个复杂、互连的修饰网络。根据二氢呋喃去环化步骤的顺序，该网络支持至少两条主要修饰路线：PT-PTR-OC和PTR-PT-OC。他们然后探索不同酶组合以进一步解开这个“修饰迷宫”，旨在实现光甘草定生产。

      他们首先测试了PcM4DT-GgPTR2-GgOC1，其按预期催化顺序进行：PT-PTR-OC，并连续将8转化为11，或12转化为15（图4b）。由于GgPTR2的广谱性，也检测到副产物如9和13。在此设计中，他们观察到中间体8的积累，表明异戊烯基转移反应低效——可能由于异戊烯基供体DMAPP供应不足。为解决此问题，他们动态调控ERG20基因并过表达关键限速酶（tHMG1和tIDI1）以增强DMAPP供应。

       在替代配置（PTR-PT-OC）中，GgPTR1、GgPT1和GgOC1组装成单个模块。当补充额外去甲基化步骤时，此模块生成梯状代谢网络（图4c）。在此架构中，广谱酶——PTR、PT和OC——作用于两条平行代谢路线的不同中间体，进一步由DMT互连，导致灵活且交织的生物合成网络。DMT的选择显著影响网络行为。使用中等活性DMT NhPDA1，代谢通量分布于多条路线，形成多路线架构，其中各种中间体向最终产物光甘草定汇聚（图4d）。这种代谢模式非常接近他们在光果甘草中检测到的（图1a-b），表明光果甘草可能也含有类似多路线架构。尽管NhPDA1可将8转化为12，但由于GgPTR1快速将8转化为9，此路线未观察到。此外，他们观察到通量优先流向化合物10，而向13的转化仍低。48小时后，10的去甲基化成为主导，启动光甘草定生产。此设置产生0.9 mg/L光甘草定（图4d）。然而，化合物14随时间积累，表明OC步骤存在瓶颈。相反，具有异常高去甲基化活性的GgDMT1主要驱动从化合物9到13的通量，有效创建流线型单路线途径（图4e）。在此模式中，9被优先消耗，因此中间体10、11和12未积累到可检测水平。检查光甘草定产量时，令人惊讶的是，简化的单路线设计实现了远低于复杂多路线“梯子”网络的生产力（图4）。

      他们分析了发酵期间中间体分泌（图4f）。其中，关键代谢节点13显示最高细胞外比例，达到88.4±4.2%相比其他。这广泛泄漏解释了简化单路线设计中观察到的较低整体产量。相反，尽管9和13强烈外流，多路线网络维持比单路线更高的稳健性水平。实际上，异戊烯基化由于增加疏水性而减少细胞外分泌，而去甲基化促进分泌到介质中。这表明甲基化和异戊烯基化均作为自保留策略，最小化其通过分泌的损失。为验证这些观察，他们构建了代谢通量模型，其证实实验趋势并进一步支持网络行为（图4g）。有趣的是，该模型还表明将去甲基化步骤移近途径末端可大幅改善光甘草定生产（图4h）。

      为实现酿酒酵母中光甘草定的从头生物合成，引入14个酶建立核心骨架模块（葡萄糖到化合物8），实现从葡萄糖逐步生物合成liquiritigenin、甲氧基甲酰净并最终紫檀苷。核心途径建立后，引入修饰模块（GgPTR1-GgPT1-GgOC1-GgDMT1），GgDMT1由氰胺诱导DDI2启动子控制（P5）。此外，为缓解光甘草定从头生物合成的限制，过表达限速酶并增强NADPH供应。最终，此完全工程酵母菌株在摇瓶发酵中实现光甘草定从头生产，最终滴度达0.5 mg/L（图4i）。

图4. 在工程酵母中光甘草定的从头生物合成

四．讨论与展望

       在本研究中，他们结合高质量基因组组装与整合转录组分析，系统绘制了光甘草定的迷宫般生物合成网络，并在酿酒酵母中从葡萄糖实现了从头生产。据他们所知，本工作提供了光甘草定的完整生物合成路线及其完全微生物生物合成。在此途径中，他们发现了几个转化，包括植物去甲基化步骤作用于O-甲基化异黄酮。通过组装关键修饰酶，他们揭示了由一组广谱酶介导的梯状网络架构，通过多个互连路线增强途径稳健性。与经典线性代谢途径不同，多路线设计耐受代谢通量波动，有助于改善整体生产力。此外，与植物使用消除保护基团需求的酶的传统期望相反，他们发现多步保护和去保护机制似乎对异黄酮后修饰衍生物如光甘草定的合成必需。这种对可逆修饰——如甲基化-去甲基化——的意外依赖揭示了植物生物合成途径中的调控层。阐明这些动态过程可能实现更有价值的天然产物的更高效生物合成生产，并提供对植物代谢网络复杂性和控制的更广泛洞见。此外，尽管使用酵母作为模型系统调查，他们的研究还为甘草物种中生物合成途径的进化适应提供了洞见。观察到的代谢广谱性和冗余可能代表一种进化策略，以最大化生态适应性同时最小化遗传负担，通过利用有限数量的基因拷贝确保跨多样环境条件的代谢韧性和灵活性。

        虽然他们重建了主要生物合成路线，但进一步途径优化仍存在几个挑战。由GgOC1催化的氧化环化步骤表现出低催化效率，成为光甘草定生物合成的限速步骤。此外，尽管他们尝试使用酵母微粒体体外重构GgPT1活性，但未检测到可测量活性。由于多通芳香异戊烯基转移酶易于在其天然膜环境外丧失活性，这可能反映当前重构系统的限制而非催化功能缺失。

        此外，他们的途径搜索依赖已知类型的酶反应，推断路线反映合理生物合成可能性而非甘草中天然途径的明确重建。甘草可能使用尚未描述的酶或反应化学，此类步骤不会被计算模型捕获。确定此处鉴定的关键酶是否在内源途径中功能最终需要植物内遗传证据。虽然甘草中的基因沉默方法尚未为此目的建立，但开发此类遗传工具代表未来工作的重要方向。这些进展将实现PTR、PT、OC和DMT基因的靶向敲低或敲除，并允许直接评估其在光甘草定生物合成中的作用。

       此外，虽然他们建立了两条主要生物合成路线，但网络的某些分支（图1）由于缺失或未鉴定酶仍不完整。他们同意验证这些反应的将进一步增强拟议光甘草定迷宫般网络的真实性。然而，无法进行这些测定反映实验限制而非反对这些分支存在的证据。尽管如此，关键中间体如化合物19和21在光果甘草中的存在支持这些分支的生化可行性。未来努力发现并整合这些酶可完全实现光甘草定生物合成网络的潜力，实现光甘草定及其结构相关衍生物的更高效和多功能生产。

      总体而言，他们的工作不仅为光甘草定生物合成提供了蓝图，还突出了一个可概括原则：迷宫般、多路线架构可赋予微生物细胞工厂增强的代谢韧性，提供合成复杂植物天然产物的策略。此外，此类可扩展和可持续微生物生产系统的开发为直接植物提取提供了高度有前景的替代方案，这对稀有光果甘草的野生保护至关重要。

参考文献

Zhang, Z., Li, W., Meng, F., Jin, Y., Sun, W., Kuang, Q., Ren, S., Liu, W., Zhang, L., Qin, L., Lv, B., Jia, H., & Li, C. (2026). Discover the maze-like network for glabridin biosynthesis. Nature communications, 10.1038/s41467-026-68881-8.

https://doi.org/10.1038/s41467-026-68881-8