TRENDS FOOD SCI TECH：葡萄及葡萄制品中的赭曲霉毒素A

葡萄及葡萄制品中的赭曲霉毒素A

期刊：TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY（15.4）

发表日期：2006年

 

 

摘要

 

赭曲霉毒素A（OTA）是一种具有强肾毒性的化合物，于20世纪90年代首次在葡萄酒中被检出。此后多项研究证实，多种葡萄制品均存在该毒素污染风险。葡萄在田间即可被OTA污染，主要致病菌为黑曲霉组真菌（以炭黑曲霉为主）。多种因素可影响黑曲霉组真菌在葡萄上产毒。目前已开展多项降低葡萄真菌污染及OTA污染的研究，但防控效果存在差异。本文综述葡萄及葡萄制品中OTA的污染现状、检测方法与相关法规，分析OTA污染来源，并探讨葡萄酒及其他葡萄制品中OTA的防控策略。

 

引言

 

赭曲霉毒素A（OTA）是一类聚酮类真菌毒素，可污染谷物、咖啡豆、坚果、可可、豆类、啤酒、葡萄酒、香辛料及葡萄干等多种植物源性产品。首次在葡萄酒中检出OTA后，该毒素在各类葡萄制品中均有报道。

OTA主要由曲霉属和青霉属真菌产生：在欧洲，疣孢青霉是谷物OTA污染的主要产毒菌；而曲霉属真菌则是咖啡与葡萄制品OTA污染的主要来源。

OTA具有强肾毒性，同时兼具免疫抑制、致畸与致癌性。OTA与多种动物及人类肾病密切相关，是丹麦猪肾病的致病因子，也可引发其他动物肾脏损伤。在人类中，OTA被认为是巴尔干地方性肾病的重要诱因，该病以肾脏萎缩、肾小管变性、间质纤维化及肾小球玻璃样变为典型特征。近年研究显示，OTA还与突尼斯慢性间质性肾病、埃及尿路上皮肿瘤及睾丸癌等疾病相关。

本文系统综述葡萄及葡萄制品中OTA的污染现状、检测技术与法规标准，阐明OTA污染来源，并提出葡萄酒及葡萄制品中OTA的防控路径。

 

 

葡萄制品中的赭曲霉毒素A

 

2.1葡萄酒中OTA污染现状

首次在葡萄酒中检出OTA后，欧洲多国及其他产区均报道本地酒与进口酒存在OTA污染。澳大利亚葡萄酒中也检出低水平OTA，含量范围为0.05–0.62μg/L。

OTA是葡萄酒常见污染物，南欧温暖产区污染水平显著更高。葡萄酒OTA污染程度与葡萄园纬度相关：纬度越低，污染风险越高。相关研究表明，南部亚得里亚海岸产区葡萄酒均检出OTA，而北部白葡萄酒未检出，表明气候与地理是影响真菌定殖及OTA污染的关键因素。

南欧葡萄酒OTA最高检出值达15.6μg/L。同一产区内，红葡萄酒OTA含量通常高于白葡萄酒，主要原因是红葡萄酒浸渍时间更长，更利于OTA溶出。检测数据显示，红、桃红、白葡萄酒OTA最高值分别为15.6μg/L、6.32μg/L、8.86μg/L。

 

2.2葡萄汁、葡萄酒醋及葡萄干中OTA污染

葡萄汁是儿童主要消费饮品，其OTA污染备受关注。多项研究显示葡萄汁OTA检出率较高，红葡萄汁尤为突出，白葡萄汁相对较低。德国一份葡萄汁样品OTA含量高达5.26μg/L。所有浓缩葡萄汁均被OTA污染。在红白葡萄汁中均检出OTA，含量为0.045μg/L。

土耳其传统浓缩葡萄汁（pekmez）由受污染葡萄汁煮沸浓缩制成，OTA浓度可升高5–6倍，达到10–50μg/L。

葡萄酒醋同样存在OTA污染。在葡萄酒醋样本中半数以上可检出OTA，所有香脂醋均检出。在所有醋样中均检出OTA，香脂醋污染最严重。在红香脂醋、白香脂醋、葡萄酒醋中分别检出6.4μg/L、3.4μg/L、1.9μg/L，三类产品平均污染水平依次为0.72μg/L、0.09μg/L、0.06μg/L。

葡萄干OTA污染水平显著高于葡萄酒与葡萄汁，部分样品可达50–70μg/kg。欧洲多国检测显示，葡萄干OTA平均污染水平为2.3μg/kg，南北欧无显著差异。美国检测数据显示，葡萄干OTA均值呈现逐年上升趋势。

 

 

葡萄制品OTA相关法规

 

欧盟相关法规规定了谷物中OTA限量，并规范了采样方法。葡萄干等干果类产品OTA最大限量为10μg/kg。葡萄酒与葡萄汁饮料OTA最大限量为2μg/L。部分国家及采购商执行更严格内控标准，限量低至0.5μg/kg。

为降低葡萄酒OTA风险，欧盟相关研究项目基于HACCP体系，建立了覆盖田间到消费全链条的预防、控制、规范生产与质量管控策略。

 

OTA检测分析方法

 

OTA检测流程主要包括：采样、提取、净化富集、分离、定量检测与阳性确证。OTA在中性/碱性条件下呈解离态，通常采用酸化有机溶剂（如酸化氯仿）提取。低检出限检测需进行净化，可采用碳酸氢钠水溶液液-液分配或固相萃取（SPE）。

基于单克隆抗体的免疫亲和柱（IA）已替代传统溶剂净化法，结合反相高效液相色谱（HPLC）或酶联免疫吸附试验（ELISA）可实现高回收率、低检出限检测。对比试验显示，免疫亲和柱对OTA回收率优于C18及聚合物基SPE柱。

已有研究建立了聚乙二醇提取法，操作简便快速且无需有机溶剂；也开发了微萃取技术，可作为免疫亲和柱的低成本替代方案。分子印迹固相萃取（MISPE）备受关注，其优势为聚合物可重复使用。

葡萄酒与啤酒中OTA推荐检测方法为：样品经PEG与碳酸氢钠稀释，免疫亲和柱净化，HPLC-荧光检测器检测。该方法也被用于葡萄中OTA检测，但实验室间比对精密度偏低。

后续改进技术包括自动化HPLC检测法及直接进样反相HPLC法。对比试验显示，SPE-HPLC-MS/MS与IA-HPLC-FLD检测结果一致性好、性能稳定。稳定同位素稀释HPLC-MS/MS法准确度高，但成本较高。

免疫化学方法可用于快速筛查。IA-ELISA法符合欧盟2μg/L限量要求，实验室间比对结果与HPLC具有可比性。

电化学免疫传感器与阵列生物传感器可实现快速高灵敏检测。基于生物传感器与试纸条的快速低成本筛查技术是OTA检测的重要发展方向。

 

OTA产毒菌及葡萄OTA污染来源

 

地中海国家、巴西、阿根廷、澳大利亚亚热带地区葡萄酒OTA污染主要由黑曲霉组真菌引起。黑曲霉组真菌主要来源于土壤，也可从多种基质分离，是葡萄重要机会致病菌，可引发果穗酸腐、浆果腐烂及葡萄干霉变，通常侵染受损浆果。该类真菌也可导致葡萄枝枯病。

黑曲霉组中，炭黑曲霉（A.carbonarius）是最主要OTA产毒菌，产毒菌株检出率为41%–100%。此外，黑曲霉复合群、刺曲霉、管囊曲霉等也可在葡萄上产OTA。这类真菌可在较宽温度范围产毒，田间条件下可持续产毒，是葡萄、葡萄干、葡萄酒OTA污染的核心来源。

多国研究证实，葡萄干OTA污染同样由黑曲霉组真菌引起。在德国、匈牙利北部、捷克、葡萄牙/法国/意大利北部等温带冷凉产区，葡萄酒虽检出OTA，但浆果中未分离到黑曲霉组真菌。这些地区谷物OTA污染主要由青霉属引起。尽管青霉可在葡萄汁与葡萄酒中生长产毒，但田间葡萄上少见产毒青霉。仅部分北部产区报道分离到产OTA青霉。

 

 

OTA真菌分子检测技术

 

OTA由多种曲霉与青霉产生，目前已建立多种分子检测方法。基于AFLP开发了赭曲霉与炭黑曲霉的种特异性引物，可用于咖啡豆中目标真菌定量检测。基于RAPD序列开发PCR引物，用于炭黑曲霉及产OTA曲霉/青霉检测。

基于钙调蛋白基因开发引物，可检测炭黑曲霉与日本曲霉；基于ITS序列开发通用引物，可同时检测赭曲霉、黑曲霉、炭黑曲霉、疣孢青霉等多种产毒真菌。研究鉴定了OTA生物合成关键聚酮合酶（PKS）基因，并据此开发引物，可检测多种产OTA曲霉与青霉。同类PKS特异性引物也被广泛应用，可用于葡萄与葡萄干中产毒真菌快速检测。

 

葡萄OTA污染影响因素

 

真菌在葡萄上的定殖受多重因素影响。气候与年份影响显著，同一葡萄园葡萄酒OTA含量年际间差异明显。地理位置至关重要，地中海盆地（法国南部、意大利南部、希腊、葡萄牙与西班牙部分地区）污染风险最高。南部炎热干燥产区可分离到大量产毒黑曲霉组真菌，而北部温和产区极少分离到；部分国家仅南部产区分离到产毒菌。

相关研究显示，土壤是葡萄园黑曲霉组真菌主要初侵染源；精耕土壤真菌分离率高于免耕土壤，藤下土壤霉菌数量高于行间土壤。

葡萄健康状况是OTA污染关键：腐烂/受损浆果OTA含量显著高于健康果。浆果损伤主要来自葡萄花翅小卷蛾等害虫、病原菌侵染、涝害或雨水裂果。研究证实，幼虫蛀孔数量与葡萄OTA浓度呈显著正相关，使用相关杀虫剂可有效降低葡萄酒OTA含量。

不同葡萄品种对炭黑曲霉定殖与OTA积累的敏感性存在差异，果皮厚度也影响污染程度，为抗病育种提供依据。

 

酿酒过程中OTA的迁移规律

 

酿酒过程中OTA迁移规律研究结论存在一定差异。示踪试验显示，OTA在浸渍阶段升高，固液分离时随果渣大量去除。相关研究也证实，大部分OTA随葡萄皮渣去除。

发酵过程中OTA可与葡萄蛋白、酵母细胞壁结合；膨润土可吸附结合OTA的蛋白，使OTA降低约67%。苹果酸-乳酸发酵阶段可去除大部分OTA，可能与乳酸菌作用相关。也有研究观察到压榨后OTA升高，苹果酸-乳酸发酵期达到峰值后下降，推测与乳酸菌降解或酵母细胞壁吸附有关。另有研究发现酒精发酵过程中液相OTA持续下降。

 

葡萄与葡萄酒OTA减控措施

 

科学的葡萄园管理可使葡萄酒OTA降低约80%。黑曲霉组防控重点为转色初期至成熟期，降低田间真菌发生率。炭黑曲霉综合防控策略包括：

栽培调控：合理修剪、灌溉，培育松散通风果穗；虫害防控：转色至采收期严防害虫损伤；减少机械/日灼/裂果损伤；土壤管理：降低藤下真菌数量；采收前剔除腐烂果是最经济有效的减控措施。

杀菌剂防控方面，早期研究表明，磺酰胺类、克菌丹等对黑曲霉组有抑制效果。近年研究显示，嘧菌酯+硫磺、敌螨普+硫磺可有效降低OTA；部分复配杀菌剂防控效果突出，其中咯菌腈为关键活性成分。相关研究显示，多种杀菌剂对降低真菌定殖与OTA效果最优。需注意，部分杀菌剂可能刺激OTA合成。

生物与物理减控方面，植物乳杆菌、酒酒球菌、木炭、明胶、酵母细胞壁制剂等均可吸附降低OTA。适量添加不影响葡萄酒色泽与风味，高剂量则可能改变感官品质。灭活酿酒酵母、酵母壁制剂对OTA均有良好吸附效果。

 

结论

 

本文系统梳理了葡萄及葡萄制品中OTA污染现状、检测技术与法规标准。葡萄OTA污染主要由黑曲霉组真菌引起，南欧等温暖产区污染风险更高。目前已通过农艺、生物、化学等手段开展OTA减控研究，但防控效果不一，部分结论尚存争议。未来需进一步研发高效、安全、绿色的真菌污染与OTA控制技术，支撑葡萄与葡萄酒产业高质量发展。