上海交大：综合转录组和WGCNA揭示VvMYB44-VvERF045复合物通过激活葡萄中VvSPS4的表达参与脱落酸诱导的糖分积累

导读

植物激素在调控果实成熟和品质（尤其是可溶性糖积累）中发挥着关键作用。然而，激素诱导葡萄果实糖积累的分子机制尚不明确。本研究表明，脱落酸（ABA）可促进葡萄浆果的成熟并提高可溶性糖含量。研究者利用激素处理后的葡萄浆果转录组数据，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了一个与糖积累相关的潜在调控网络。进一步，研究者鉴定出5个响应ABA且可能调控葡萄浆果糖积累的结构基因（SGs）和44个转录因子（TFs）。其中，VvMYB44因在ABA处理后的成熟果实中表达量最高而受到关注。该转录因子能结合VvSPS4启动子并激活其表达，从而影响蔗糖代谢。此外，VvERF045与VvMYB44互作，进一步增强其对VvSPS4的转录激活作用。在番茄果实中过表达VvERF045同样提高了可溶性糖含量。这些发现揭示了VvMYB44–VvERF045复合体在糖积累中的作用，并为葡萄果实糖积累的分子机制提供了新的见解。。

 

论文ID

 

原名：VvMYB44–VvERF045 complex is involved in abscisic acid-induced sugar accumulation by activating VvSPS4 expression in grapes

译名：VvMYB44–VvERF045 复合物通过激活葡萄中VvSPS4的表达参与脱落酸诱导的糖分积累

期刊：Horticulture Research 

IF：8.5

发表时间：2026.2

通讯作者：纠松涛

通讯作者单位：上海交通大学农业与生物学院

DOI号：10.1093/hr/uhaf318

 

实验设计

 

结果

 

1 ABA处理对葡萄浆果成熟和可溶性糖含量的影响

为探究ABA对果实成熟和可溶性糖含量的影响，研究者以转色前期‘Muscat Hamburg’葡萄浆果为材料，施用500 mg L^-1的ABA。ABA处理加速了果实的成熟进程，表现为果皮着色提前和浆果膨大增强（图1A）。与对照相比，ABA处理后果实重量、赤道径（ED）和纵径（LD）均显著增加（补充数据图S1A–C）。值得注意的是，与对照相比，施用ABA使总可溶性固形物（TSS）积累更快、含量更高（补充数据图S1D）。此外，ABA处理浆果中葡萄糖和果糖的含量更高且积累更迅速。蔗糖在葡萄浆果中保持较低水平，在处理后36天未见显著变化（图1B–D）。因此，ABA强烈促进了葡萄浆果中可溶性糖的积累。为了全面解析成熟过程中的全基因组转录响应，对ABA处理的‘Muscat Hamburg’葡萄浆果进行了RNA-seq分析。经过接头修剪和质量过滤（Q30 ≥ 91.99%）后，将干净读段（每样品5.92–10.24 Gb）比对至葡萄参考基因组，比对率为68.48%–92.76%（附表S1）。21个样品中共检测到26087个基因表达，三个生物学重复间表现出高度相关性（附表S2）。

图1：ABA处理促进‘Muscat Hamburg’葡萄果实成熟及可溶性糖积累。（A）对照与ABA处理下葡萄浆果的表型。标尺 = 1 cm。（B-D）对照与ABA处理下葡萄浆果的蔗糖（B）、葡萄糖（C）和果糖（D）含量。数据以均值±标准差（n=3）表示。* 表示与对照相比差异显著（P＜0.05），** 表示与对照相比差异极显著（P＜0.01）。

2 加权基因共表达网络的构建

为深入了解ABA处理对葡萄浆果代谢变化的调控效应，研究者利用14个样品的转录组数据进行WGCNA分析。聚类树状图显示生物学重复间具有高度相关性，分支代表了表达模式相似的样品（图2A）。基于表达谱相似性，共鉴定出10个共表达模块（图2B；附表S3）。模块-性状相关性热图表明，棕色（brown）、蓝色（blue）、品红色（magenta）和蓝绿色（turquoise）模块中的转录本与关键性状（包括蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖的积累）呈负相关，而这些糖在成熟过程中显著增加（图2C）。这些结果表明，这四个模块中的基因主要与‘Muscat Hamburg’葡萄果实的成熟和可溶性糖积累过程相关。

图2：加权基因共表达网络的构建。（A）‘Muscat Hamburg’葡萄转录组样品的聚类树状图。（B）通过WGCNA鉴定的共表达模块聚类树状图。主树分支构成10个模块。（C）模块-性状相关性热图，每行对应一个不同颜色的模块，每列对应一个性状。黄色表示正相关，紫色表示负相关。

3 可溶性糖代谢调控网络的构建

为进一步探究可溶性糖代谢的潜在转录调控机制，研究者基于对照和ABA处理葡萄浆果的上述转录组数据集，以特征基因连接值阈值（|KME| ≥ 0.8）从棕色（brown）、蓝色（blue）、品红色（magenta）和蓝绿色（turquoise）模块中筛选了参与可溶性糖代谢和转运的结构基因（SGs）以及转录因子（TFs）。该过程共鉴定出19个SGs，包括INVs、SSs、SPSs、SUCs、HTs和SWEETs，以及135个TFs，如MYBs、WRKYs、ERFs、ARFs、NACs、bZIPs和bHLHs（附表S5）。随后，研究者进一步筛选出12个表达水平与三种可溶性糖积累模式高度相关的SGs，并鉴定出128个与这12个SGs密切相关的TFs。将该基因集可视化为相关性网络（图3A；附表S6）。此外，研究者提取了这140个基因的表达水平。其中，5个SGs和44个TFs在ABA处理组与对照组之间呈现差异表达（图3B；附表S7）。这些结果表明，该调控网络中鉴定出的49个基因可能响应ABA信号，并在调控葡萄浆果可溶性糖代谢中发挥关键作用。

图3：‘Muscat Hamburg’葡萄可溶性糖调控网络及候选基因表达热图。（A）蔗糖、果糖和葡萄糖的调控网络。六边形代表三种可溶性糖，八边形代表参与其代谢与转运的结构基因，圆形代表转录水平与SGs表达相关的转录因子。（B）RNA-seq数据中差异表达候选基因的表达热图。C0、C1、C2、C3分别对应对照组处理后0天、7天、15天、36天的浆果；A1、A2、A3分别对应ABA处理组处理后7天、15天、36天的浆果。

4 VvMYB44调控葡萄愈伤组织和番茄中的可溶性糖积累

为评估调控网络中基因的作用，研究者重点关注了在上述44个TFs中于ABA处理后的成熟果实中表达量最高的VvMYB44基因（附表S7）。研究者成功从‘Muscat Hamburg’葡萄中克隆了VvMYB44的全长编码序列（CDS）。系统进化分析表明，VvMYB44属于R2R3-MYB家族，与拟南芥AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77具有同源性（图4A）。研究者将VvMYB44-YFP融合蛋白与核标记物在本氏烟草叶片中瞬时共表达，观察到VvMYB44-YFP与NLS-mCherry完全共定位，证实VvMYB44定位于细胞核（图4B）。随后，研究者检测了VvMYB44在‘Muscat Hamburg’葡萄浆果发育各阶段的表达模式。VvMYB44转录本在花后60至110天（DPA）呈现高丰度（图4C）。为研究VvMYB44在调控靶基因及影响糖积累中的功能，研究者构建了三个过表达VvMYB44的葡萄愈伤组织株系（株系2、4和5）（图4D）。通过qRT-PCR分析验证了遗传转化的有效性（图4G）。值得注意的是，与野生型（WT）相比，三个过表达株系中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量均显著升高（图4E）。调控网络分析显示，VvMYB44与10个参与糖代谢的SGs（包括INVs、SSs、SPSs和SWEETs）存在强相关性（图4F）。研究者检测了一些重要靶基因的表达，发现VvNINV3、VvSS2、VvSPS4和VvERD6L8在VvMYB44过表达愈伤组织中上调表达（图4G）。基于这些相关性，研究者将VvNINV3、VvSS2和VvSPS4确定为VvMYB44的候选靶基因。此外，研究者在番茄中构建了三个过表达VvMYB44的株系（株系1、3和7）（图4H–J）。与葡萄愈伤组织中的结果一致，过表达番茄果实中的可溶性糖含量显著升高（图4K）。研究者进一步分析了候选靶基因同源物在过表达番茄果实中的表达水平，发现与WT相比，SlLIN7、SlLIN8、SlNINV、SlVINV、SlSS4、SlSPS、SlSPS4和SlSPSB显著上调（补充数据图S2A）。此外，番茄中其他与糖积累相关的基因，如SlSUT1、SlSUT4、SlTST1和SlTST2，在VvMYB44过表达株系中也均被显著诱导（补充数据图S2B）。综上所述，这些结果表明VvMYB44通过调控葡萄浆果中VvNINV3、VvSS2和VvSPS4的表达，在可溶性糖积累中发挥关键作用。

图4：VvMYB44调控葡萄愈伤组织和番茄果实中糖积累及相关基因表达。（A）采用邻接法（NJ）并经过1000次bootstrap检验构建的VvMYB44及其在葡萄和拟南芥中同源蛋白的系统进化分析。（B）VvMYB44在本氏烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位，与核定位标记（NLS-mCherry）和VvMYB44-YFP共表达。标尺 = 10 μm。（C）VvMYB44在果实发育和成熟过程中的转录丰度。（D）野生型（WT）与过表达VvMYB44的葡萄愈伤组织表型。标尺 = 1 cm。（E）WT与VvMYB44过表达葡萄愈伤组织中蔗糖、果糖和葡萄糖的含量。（F）VvMYB44的转录调控网络；六边形代表糖类，菱形代表VvMYB44，圆形代表相关SGs。红线表示正相关，蓝线表示负相关。（G）VvMYB44过表达愈伤组织中VvMYB44及调控网络中靶基因的相对表达水平。（H）VvMYB44过表达株系与WT的果实表型。标尺 = 1 cm。（I, J）VvMYB44过表达株系的转基因鉴定。（K）VvMYB44过表达株系与WT果实的可溶性糖含量。数据以均值±标准差（n=3）表示。* 表示与WT植株相比差异显著（P＜0.05），** 表示与WT植株相比差异极显著（P＜0.01）。

5 VvMYB44结合VvSPS4启动子区域并增强其表达

为探究VvMYB44是否通过转录激活介导可溶性糖积累，研究者首先扫描了三个候选靶基因的启动子区域。分析发现，仅在VvSPS4启动子中存在AtMYB44的结合基序。研究者通过酵母单杂交（Y1H）实验证实VvMYB44可与VvSPS4启动子结合。研究者将VvSPS4启动子插入pLacZi载体，VvMYB44的CDS插入pB42AD载体。同时含有proVvSPS4-pLacZi和VvMYB44-pB42AD构建体的EGY48酵母菌株在含X-gal的SD/-Trp/-Ura培养基上呈现蓝色，而含有proVvSPS4-pLacZi与空pB42AD质粒的酵母细胞未变蓝（图5A）。此外，鉴于VvSPS4启动子中存在MBS基序，研究者利用VvMYB44-His融合蛋白进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）。结果表明，VvMYB44-His能直接结合MBS基序。重要的是，竞争性冷探针显著降低了VvMYB44与VvSPS4启动子结合的信号，而突变探针则破坏了结合（图5B）。这些发现证实了体外条件下VvMYB44与VvSPS4启动子之间的相互作用。随后，研究者在烟草叶片中进行了双荧光素酶报告基因（DLR）检测。研究者将VvMYB44克隆至效应载体，VvSPS4启动子克隆至pGREENII0800报告载体（图5C）。共表达35S::VvMYB44和proVvSPS4-LUC的叶片表现出比表达空载体和proVvSPS4-LUC的叶片更强的发光强度（图5D）。综上所述，这些结果表明VvMYB44结合VvSPS4启动子区域，在体内和体外增强其表达。

图5：VvMYB44直接结合VvSPS4启动子并激活其表达。（A）Y1H实验显示VvMYB44在体外结合VvSPS4启动子。（B）EMSA实验证明VvMYB44在体外结合VvSPS4启动子内的顺式作用元件。“+”和“−”分别表示存在或不存在相应探针或重组蛋白。（C）DLR实验所用报告载体和效应载体的示意图。（D）DLR实验显示VvMYB44激活VvSPS4启动子活性，上图：浸润相应载体的烟草叶片发光图像；下图：相对LUC/REN活性的定量分析。REN活性作为内参。数据以均值±标准差（n=5）表示。* 表示与空载体（EV）组相比差异显著（P＜0.05），** 表示差异极显著（P＜0.01）。

6 VvMYB44与VvERF045协同激活VvSPS4表达并促进可溶性糖积累

为进一步研究VvMYB44如何调控可溶性糖积累，研究者进行了酵母双杂交（Y2H）实验，以评估VvMYB44与VvERF045（乙烯、BR和ABA通路的关键整合因子）之间的相互作用。如图6A所示，同时含有VvMYB44-pGBKT7和VvERF045-pGADT7的酵母细胞在含X-α-Gal的SD/–Trp/–Leu/–Ade/–His培养基上生长良好并呈现蓝色。随后，研究者使用GST抗体包被的树脂进行了pull-down实验。结果显示，VvMYB44-GST直接结合VvERF045-His，而单独的GST未显示结合（图6B）。为验证体内相互作用，研究者在烟草叶片中进行了双分子荧光互补（BiFC）实验。共表达VvMYB44-nYFP和VvERF045-cYFP对导致功能性YFP在细胞核内重建，而在对照组合中未观察到YFP信号（图6C）。此外，免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，在VvMYB44-GFP存在下，使用anti-GFP能够共沉淀VvERF045-Myc，而阴性对照中未检测到Flag信号（图6D）。这些发现共同证实了VvERF045在体外和体内均与VvMYB44相互作用。为评估这种相互作用是否影响VvSPS4的转录调控，研究者利用上述报告载体和效应载体以及额外的35S::VvERF045效应载体，在烟草叶片中进行了DLR检测（图6E）。与单独表达VvMYB44相比，共表达VvMYB44和VvERF045进一步增强了VvSPS4启动子驱动的发光强度和LUC活性（图6F和G）。为探究VvERF045是否影响可溶性糖积累，研究者构建了三个过表达VvERF045的番茄株系（株系2、3和5），并验证了转化成功（图6H–J）。值得注意的是，与WT相比，所有三个过表达株系中的葡萄糖、果糖和蔗糖水平均显著升高（图6K）。综上所述，这些结果表明VvMYB44与VvERF045协同激活VvSPS4的表达，并促进可溶性糖积累。

图6：VvMYB44与VvERF045物理互作，进一步增强VvSPS4的表达。（A）Y2H实验显示VvMYB44与VvERF045在体外相互作用。SD/−TL表示SD/−Trp/−Leu培养基；SD/-TLHA + X表示SD/−Trp/−Leu/−His/−Ade/+ X-α-Gal培养基。（B）Pull-down实验显示VvMYB44在体外与VvERF045相互作用。“+”和“−”表示存在或不存在相应蛋白。（C）BiFC实验显示VvMYB44与VvERF045在本氏烟草叶片中相互作用。未融合的nYFP和cYFP作为对照。（D）Co-IP实验验证VvMYB44与VvERF045在体内相互作用。“+”和“−”表示存在或不存在相应蛋白。（E）DLR实验所用报告载体和效应载体的示意图。（F, G）DLR实验显示VvMYB44–VvERF045互作对VvSPS4转录激活的影响，（F）烟草叶片发光图像，（G）相对LUC/REN活性的定量分析。REN活性作为内参。数据以均值±标准差（n=5）表示。（H）VvERF045过表达株系与WT的果实表型。标尺 = 1 cm。（I, J）VvERF045过表达株系的鉴定。（K）VvERF045过表达株系与WT果实中三种糖的含量。数据以均值±标准差（n=3）表示。* 表示与WT植株相比差异显著（P＜0.05），** 表示与WT植株相比差异极显著（P＜0.01）。

讨论

 

果实成熟的研究长期以来受到果树中缺乏大规模突变体库的显著限制。因此，大多数研究依赖于在果实发育不同阶段施用多种激素或化合物，随后进行大量取样以及转录组学和代谢组学分析，以揭示其对转录本丰度和代谢物含量的影响。ABA是调控跃变型和非跃变型果实成熟过程的关键调控分子。在大多数肉质果实（包括草莓、葡萄和番茄）的成熟过程中，内源ABA水平通常升高。外源ABA处理也能促进果实甜度、着色和风味。例如，经ABA处理后的‘Summer Black’葡萄比未处理葡萄提前15天成熟，且可溶性糖和花青素含量显著升高。ABA处理还能显著加速甜樱桃果实的软化，并促进番茄中类胡萝卜素、酚类物质和芳香挥发性物质的积累。此外，施用ABA和氟啶酮（一种ABA抑制剂）分别促进和抑制了苹果中的糖积累。本研究中，ABA处理促进了葡萄浆果的成熟，具体表现为着色增强和可溶性糖含量增加（图1）。总体而言，这些发现强调了ABA是多种不同果实物种中一个普遍且必需的成熟调控因子。

大量转录因子已被鉴定为果实成熟和糖积累的关键调控因子，它们通过调控参与糖代谢、转运和植物激素合成的基因表达发挥作用。例如，ClNAC68通过抑制ClINV正向调控西瓜中的糖积累。MaMADS36结合MaBAM9b启动子，激活其转录，从而促进香蕉果实成熟过程中的淀粉降解。MdERDL6介导的葡萄糖循环激活SnRK2.3-AREB1-TST1/2级联模块，导致苹果和番茄中的糖水平升高。在葡萄中，受蔗糖和ABA信号诱导的VvMSA通过激活VvHT1正向调控糖积累。VvERF105和VvNAC72以相反的方式调控VvSWEET15的时空表达，从而影响葡萄浆果成熟过程中的糖积累。在本研究中，通过构建可溶性糖相关的调控网络，研究者鉴定出44个转录因子，包括MYB、WRKY、ERF、NAC和bHLH等家族成员，它们可能响应ABA信号，调控葡萄浆果中的可溶性糖代谢（图3）。研究者进一步验证了VvMYB44在调控葡萄愈伤组织和番茄可溶性糖积累中的正向作用（图4）。值得注意的是，最近一项研究报道了VvMYB44在高温诱导抑制葡萄浆果花青素生物合成中的作用。本研究的发现表明，VvMYB44通过转录激活VvSPS4的表达，从而促进葡萄中的蔗糖代谢（图5）。综上所述，这些结果强调了VvMYB44在果实成熟和可溶性糖积累中的重要且多样化的功能。

蔗糖在碳水化合物代谢中起着关键作用，是叶片光合同化物向果实运输的主要形式。SPS是蔗糖合成的限速酶，催化6-磷酸果糖和尿苷二磷酸葡萄糖转化为6-磷酸蔗糖，随后由SPP水解生成蔗糖。自从第一个SPS基因从玉米中分离以来，已在多种物种中鉴定出同源基因，包括拟南芥、水稻、小麦、番茄和苹果。SPS基因在营养生长和生殖生长过程中为提供能量发挥重要作用。AtSPSA1参与拟南芥叶片中的光合蔗糖合成。值得注意的是，水稻sps1突变体表现出花粉不育。过表达SoSPS1已被证明可以提高甘蔗中的蔗糖水平。在果实作物中，SPS酶活性与蔗糖含量之间存在强相关性。例如，在香蕉果实成熟过程中，SPS活性随蔗糖快速积累而显著增加。CmSPS1参与了乙烯诱导的跃变型甜瓜果实采后蔗糖积累。过表达FaSPS3提高了草莓果实中的蔗糖水平。此外，在‘金冠’苹果成熟过程中，MdSPSA2.3的表达也与蔗糖含量呈正相关；沉默MdSPSA2.3导致蔗糖积累显著受抑制。本研究中，研究者发现VvSPS4是VvMYB44促进葡萄可溶性糖积累的功能靶点（图5）。类似地，MaNAC19已被证明直接激活MaSPS1以促进香蕉中的蔗糖合成。CitSAR直接结合CitSPS4启动子上的GCC-box，激活其表达及柑橘果实中的蔗糖代谢。因此，理解SPS基因的分子调控对于改善果实风味品质至关重要。

转录因子通常通过蛋白质-蛋白质相互作用协同调控靶基因的表达。MYB-bHLH-WD40复合物参与多种物种的花青素生物合成。MdMYB63与MdERF106相互作用，增强靶基因MdSOS1的转录活性，最终提高苹果的耐盐性。VqWRKY53通过与VqMYB14和VqMYB15相互作用，正向调控野生葡萄中芪类物质的生物合成及对Pst DC3000的抗性。转录因子寡聚体也参与控制可溶性糖积累。ABA信号调控因子MdbZIP23和MdbZIP46与MdWRKY9相互作用，增强其对MdSWEET9b的调控作用，最终促进苹果果实中的糖积累。PpNAP4与PpNAP6协同作用，通过影响PpSUS1和PpSPS2的表达，成为蔗糖合成的关键调控因子。FvNAC073–FvCMB1L复合物竞争性结合FvSPS1和FvSUS2的启动子，从而拮抗调控草莓果实成熟过程中的蔗糖积累。本研究中，VvERF045直接与VvMYB44相互作用，进一步激活VvSPS4的表达。过表达VvERF045也提高了番茄果实中的可溶性糖水平（图6）。在研究者近期研究中，VvERF045被鉴定为介导乙烯、BR和ABA通路之间交叉对话的关键整合因子，调控花青素、BR和ABA的生物合成。因此，多个转录因子的协同作用是调控植物可溶性糖积累的一个重要机制。

图7：ABA处理下VvMYB44促进葡萄可溶性糖积累的调控模型。

结论

 

在本研究中，研究者揭示了ABA对葡萄成熟和可溶性糖积累的积极促进作用。研究者利用外源激素处理‘Muscat Hamburg’葡萄浆果的转录组数据集，构建了一个可溶性糖积累的潜在调控网络。通过这一分析，研究者鉴定出5个结构基因（SGs）和44个转录因子（TFs），它们可能响应ABA信号，调控葡萄浆果中的可溶性糖代谢。值得注意的是，研究者对VvMYB44转录因子进行了功能鉴定，该因子在葡萄浆果的转色期和成熟期高表达。VvMYB44似乎通过结合VvSPS4启动子并激活其表达，从而影响蔗糖代谢。此外，研究者还发现VvERF045与VvMYB44相互作用，进一步增强其对VvSPS4的转录激活作用（图7）。这些发现为葡萄可溶性糖积累的分子机制提供了新的见解。