J AGR FOOD CHEM：锦葵色素-3-O-葡萄糖苷与葡萄酒酚类化合物相互作用的超分子研究：对颜色的影响

J AGR FOOD CHEM：锦葵色素-3-O-葡萄糖苷与葡萄酒酚类化合物相互作用的超分子研究：对颜色的影响

引言

 

花青素是属于类黄酮家族的酚类化合物，是许多水果、蔬菜、果汁、果酱和红葡萄酒中红色的最重要色素之一。红葡萄酒含有不同的花青素，其中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷是年轻葡萄酒中最丰富的一种，通常在300-500 mg/L的浓度范围内。花青素的红色归因于黄烊阳离子，这是在酸性pH（pH ≤ 2）下的稳定形式。然而，花青素极易通过不同的反应（取决于介质的pH值）改变其平面结构，这使得它们在水溶液中相对不稳定。当pH升高时，会发生水化反应，导致无色的半缩酮，或发生酸碱平衡，导致蓝紫色的醌式碱，从而降低黄烊阳离子的水平。

由于辅色效应，黄烊阳离子受到保护，免受水分子的亲核攻击。辅色效应包括花青素与其他有机分子（称为辅色素）之间的夹层堆叠。这种结合归因于非共价的疏水分子缔合，主要是花青素和辅色素的有色形式芳环之间的π-π堆叠相互作用。水化反应限制了无色化合物的形成。同样，自缔合是另一种稳定黄烊阳离子红色的机制，因为花青素自身可以作为辅色素，导致颜色强度增加。

在葡萄酒酚类化合物中，类黄酮和羟基肉桂酸是最重要的可作为花青素辅色素的化合物。众所周知，黄烊阳离子与黄烷-3-醇（如（-）-表儿茶素和（+）-儿茶素）相互作用。同样，类黄酮已显示出很强的辅色素能力，因为它们的色素-辅色素缔合常数高于黄烷醇-花青素相互作用中发现的常数。然而，它们在葡萄酒中的含量远低于黄烷醇。关于其他酚类化合物，羟基肉桂酸，特别是咖啡酸，也显示出很强的辅色效应，而苯甲酸类化合物，如没食子酸，通常作为辅色素效率较低。

然而，紫外-可见光谱法无法从超分子角度表征控制辅色过程的分子相互作用。等温滴定量热法（ITC）可用于确定热力学参数（ΔG、K、ΔH和ΔS），以研究超分子体系中的结合机制。即使相互作用很弱或在低亲和力体系条件下，该技术能够测量可逆相互作用发生的能量变化。同样，分子动力学（MD）模拟使用模型体系估算结合能值和所得复合物的稳定性，可以帮助更好地理解不同分子间的相互作用。

因此，本研究的目标是首次从超分子角度分析黄烊阳离子与已知作为辅色素的不同酚类化合物的相互作用。同时，本工作旨在建立Mv3G黄烊阳离子形式所表达的颜色变化与相互作用强度、所用力及所形成复合物特性之间的关系。为此，使用紫外-可见光谱、ITC和MD模拟分析了Mv3G与不同酚类化合物（PC）之间的相互作用，即一种黄酮醇（槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷（QG））、两种黄烷-3-醇（（-）-表儿茶素（E）和（+）-儿茶素（C））、一种羟基肉桂酸（咖啡酸（CA））和一种羟基苯甲酸（没食子酸（GA））。

 

材料与方法

 

2.1模型溶液

所有模型溶液均在酸性介质（pH 1.1）中制备。所有情况下的色素浓度相同（50 μM），选择此浓度以最小化自缔合效应。制备了五种基于Mv3G与槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷（Mv3G/QG）、咖啡酸（Mv3G/CA）、（-）-表儿茶素（Mv3G/E）、（+）-儿茶素水合物（Mv3G/C）和没食子酸（Mv3G/GA）二元组合的溶液，分别采用两种不同的色素/酚类化合物（PC）摩尔比（1:1和1:2），以评估PC浓度的影响。还制备了相同pH下的花青素参比溶液。所有溶液均制备三份，并在25℃下避光保存2小时以达到平衡。

 

2.2颜色分析、2.3等温滴定量热法测定、2.4分子建模和分子动力学（MD）模拟、2.5统计分析

详见原文。

 

结果

 

3.1颜色测定

在pH 1.1下制备了Mv3G与PC的二元溶液，采用两种不同的摩尔比（1:1；1:2），以评估Mv3G/PC相互作用对花青素黄烊阳离子颜色的影响。在此pH下，有色的黄烊阳离子占主导地位，通过测定CIE Lab参数（L*、a*、b*、C*ab和hab），可以评估由于这些相互作用而可能产生的相对于纯花青素的颜色变化。

 

 

在pH 1.1的Mv3G溶液中加入QG对研究的颜色参数影响最大。在QG存在下L*、b*和hab值降低表明Mv3G溶液颜色更深、更蓝。这可能意味着Mv3G黄烊阳离子与QG芳环之间的相互作用使共轭作用延伸至整个双分子体系。已知延长分子中具有多重键的共轭体系会导致吸收向更长波长移动。QG溶液的λmax从520 nm（Mv3G对照溶液）变为Mv3G/QG2情况下的523 nm（表1），这意味着一个红移，对应于从红色到更蓝的颜色变化。

测试的其他PC，只有L*参数显示出差异，并且它向更高值移动，表明溶液向消色差方向演变，这可能表明，由于相互作用，涉及黄烊阳离子的复合物及其这些PC将显示出比游离黄烊阳离子形式更低的摩尔吸光系数。

测定的色差（ΔE*ab）仅Mv3G/QG溶液值超过3个单位，在比例为1:2时更明显（6.11个单位）。明度（%ΔL）、色度（%ΔC）和色调（%ΔH）对色差的相对贡献显示，在所研究的pH下，定性贡献在色差中明显占主导地位，色调%ΔH的贡献显著高于明度%ΔL或色度%ΔC。

结果指出，黄烊阳离子溶液（pH 1）的颜色可通过存在QG而改变，但不能通过C、E、CA或GA改变。这些观察结果导致两种可能的替代解释：（i）黄烊阳离子只与QG相互作用（而不与C、E、CA或GA相互作用；这与目前关于辅色效应的认知相悖）或（ii）QG结构允许以敏感的呈色方式改变Mv3G/QG电子环境的相互作用，但这在Mv3G/C、Mv3G/E、Mv3G/CA或Mv3G/GA相互作用中不发生。

 

3.2等温滴定量热法

等温滴定量热法（ITC）已被用于研究花青素与不同酚类化合物之间的相互作用，被证明可表征分子相互作用。ITC实验可以获取每次花青素/PC相互作用的热力学参数，即吉布斯自由能变化（ΔG）、表观结合常数（K）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）（表2）。

 

 

如表2所示，所有ΔG值均为负，表明所研究的所有体系中都发生了自发相互作用，因此，所有研究的PC都与Mv3G的黄烊阳离子相互作用。最小的ΔG值出现在含有Mv3G和QG的样品中，这表明，在所研究的酚类化合物中，QG可能是对Mv3G具有最高亲和力的。这由亲和常数（K）的值得到证实，QG的K值显著高于其他PC。根据K值，Mv3G对所研究酚类化合物的亲和力为QG > CA > E > GA > C。这与此前研究结果基本一致，表明ITC结果在亲和力方面可以与比色法所得结果进行比较。

对于Mv3G对两种所研究酚酸的亲和力发现了差异：在两种分析比例下，CA的K值均高于GA。至于黄烷醇，K值表明E对Mv3G的亲和力大于C。关于所涉及的力类型，当ΔH和−T·ΔS均为负时，疏水相互作用和氢键（H-键）两种力都会发生。基于所获得的结果，总体而言，相互作用涉及两种类型的力，即H-键和疏水键，后者略占优势。

 

3.3分子动力学（MD）模拟

MD模拟也用于评估色素Mv3G黄烊阳离子形式与所测PC之间的相互作用。通过对每次MD模拟进行聚类分析评估所形成的复合物，其中使用Mv3G所有重原子的均方根偏差作为度量（因为它们是所有体系的共有分子）。仅考虑在MD模拟过程中频率高于5%的几何构型。

表3显示了从所有MD模拟中获得的色素/PC的1:1至1:4和2:1至2:4复合物的数量和性质。形成的数量较多的1:1和1:2色素/PC聚集体表明了这些分子构建堆叠复合物的趋势。此外，在所有模拟中均观察到PC/PC复合物的形成（主要存在于含CA分子的体系中）。关于Mv3G/Mv3G聚集体，它们在含有GA和E的模拟中形成，在含CA和C的体系中频率较低，而在含槲皮素分子的模拟中不存在。这可能意味着Mv3G与PC之间的相互作用优先于两个色素分子之间的相互作用（自缔合）。

 

 

此外，还进行了具有1:1辅色复合物的MD模拟，以评估各种PC与Mv3G的结合模式。表4显示了每个Mv3G/PC复合物的结合能，而图1展示了每次MD模拟中最常见结合姿态的代表性结构。

 

 

关于焓结合能（表4），槲皮素具有最高绝对值。然后，其他被测PC分子对Mv3G的亲和顺序为E ≈ C > GA ≈ CA。槲皮素、表儿茶素和儿茶素中存在多个芳环，这可能解释了它们较高的结合亲和力，并突出了π堆叠相互作用的重要性。

这一计算排名与ITC结果极其一致，其中槲皮素是对Mv3G亲和力最高的化合物。这可以解释比色研究，其中槲皮素引起了与对照相比显著的颜色差异。还证实了范德华力是结合能的主要贡献者（表4）。此外，对所有复合物分子间相互作用的分析表明，非极性和色散接触是所有五种PC相互作用的主要驱动力。绝大多数所有色素/PC复合物中，都存在所有多酚分子芳环之间的π-π堆叠以及涉及Mv3G甲基的烷基-烷基相互作用。但是，没食子酸复合物中该复合物没有形成明显的烷基-烷基接触（图1）。

总体而言，这些数据与其他涉及花青素的辅色研究一致，其中π-π堆叠和疏水键已被明确认定为辅色作用的驱动力。此前研究MD模拟也指出，π-π堆叠和范德华接触对于驱动色素与辅色素之间的辅色作用至关重要。

此外，MD结果表明，烷基-π相互作用对于与咖啡酸、儿茶素和表儿茶素分子的复合物也很重要（图1）。涉及槲皮素的复合物通过其A、C和B环的芳环堆叠与Mv3G相互作用。其C2-C3之间的双键降低了B环的自由度，从而在空间上有利于π-π堆叠。此外，A环的负四极矩会被C-4位的吸电子基团减弱，有利于夹层和平行位移构象而非T形构象，如图1所示。这将允许扩展一个高度共轭的π键体系，该体系将体系的可见光吸收改变到更长的波长，并解释了在比色研究中证实的黄烊阳离子溶液的蓝色化。H-键也是这些分子相互作用能力的重要接触。这些亲水相互作用显著且短，突出其芳环上邻位羟基对相互作用能力的重要性和后续贡献。

 

结论

 

结果表明，在本文研究的五种PC中，最稳定的相互作用和最高的结合亲和力发现于黄烊阳离子与QG之间。在酸性pH条件下，由于溶液中存在QG，Mv3G溶液的颜色变为更深的颜色和更蓝的色调，这主要与黄烊阳离子谱带的红移有关，当QG浓度增加时效果更明显。其他被测PC对Mv3G黄烊阳离子形式颜色的影响不太明显，仅在E和GA的情况下影响溶液的明度。与MD模拟结果一致的ITC研究指出，在所测PC中，Mv3G与QG之间的相互作用最强。这可能就是溶液中QG的存在提供了最显著颜色差异的原因。还观察到E对Mv3G的结合亲和力大于C，这可以解释为何只在存在E时观察到相对于Mv3G对照的显著明度差异。关于力的类型，疏水相互作用和H-键参与了大部分色素/PC聚集体，除了Mv3G/CA2由疏水相互作用主导。