Sci. Hortic.：VvWRKY72转录因子在转基因拟南芥和葡萄植株中增强对灰霉病的敏感性

 

VvWRKY72转录因子在转基因拟南芥和葡萄植株中增强对灰霉病的敏感性

期刊：Scientia Horticulturae（4.2）

发表日期：2025年08月

 

 

背景

 

鲜食葡萄因其香气和营养品质受到消费者青睐，全球约45.09%的葡萄用于鲜食，中国是最大市场。然而，采后问题如失重、穗轴褐变、落果和真菌腐烂严重影响其品质。灰霉菌在低温下仍具强致病性，是葡萄采后贮藏中的主要病原菌。

SO₂是目前最有效的鲜食葡萄采后保鲜剂，能显著抑制病原菌生长。研究表明，SO₂的保鲜效果与葡萄防御反应相关，可上调PR基因表达及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，并调控抗氧化、次生代谢、硫同化和激素信号相关基因。然而，其分子机制尚不清晰。

植物可通过ROS信号、细胞壁加固、胼胝质沉积、植保素合成等机制防御病原菌。WRKY转录因子家族在调控植物防御中起重要作用。例如，AtWRKY33敲除会增强对灰霉菌的敏感性，而AtWRKY70抑制则可增强JA介导的抗性。在葡萄中，已有多个VvWRKY被证实正向或负向调控抗病性，但VvWRKY72的功能尚未被研究。

本研究从SO₂保鲜葡萄中筛选出显著下调的VvWRKY72基因，并通过转基因实验证明其通过干扰ROS稳态、JA信号和细胞壁防御，增强植物对灰霉菌的敏感性。

 

结果

 

2.1 选择VvWRKY72进行功能鉴定

对RNA-seq数据的重新分析，鉴定出16个在SO₂保藏组与对照组之间差异表达（|Log₂T60/C60|≥0.5849，p<0.05）的VvWRKY基因（图1A）。通过qRT-PCR进一步验证了这些VvWRKY的表达模式（图1B）。基于我们前期研究中的KEGG通路富集分析，其中4个VvWRKY基因（VvWRKY70-2、VvWRKY72、VvWRKY17和VvWRKY9）被映射到“植物-病原相互作用”通路——这是SO₂诱导防御反应的关键通路，其余12个VvWRKY基因则没有KEGG通路注释。在这4个基因中，VvWRKY72表现出最显著的下调（补充表1）。其在拟南芥中的同源基因AtWRKY72和番茄中的同源基因SlWRKY72已被证明与植物抗性相关，提示VvWRKY72可能参与类似的生物学过程。因此，我们选择VvWRKY72进行进一步的功能分析。

 

 

2.2 VvWRKY72基因在葡萄中的染色体定位与结构

生物信息学分析显示，VvWRKY72基因（GenBank登录号：LOC100250047）位于葡萄第17号染色体上（图2A）。VvWRKY72的全长cDNA序列包含一个1818bp的开放阅读框，编码一个605个氨基酸的蛋白质（图2B和2C）。系统发育分析表明，VvWRKY72是AtWRKY72的直系同源物，与甜橙（CsWRKY72）和番茄（SlWRKY72）的亲缘关系最近（图2D）。预测的VvWRKY72蛋白序列比对显示其含有一个WRKY结构域和一个C₂H₂型锌指结构（C-X₅-C-X₂₃-H-X-H），属于IIb亚家族WRKY转录因子（图2E）。VvWRKY72启动子区含有应激响应的顺式调控元件，包括低温响应元件（LTR）、ABA响应元件（ABRE）、WRKY结合位点（W-box）和MYB结合位点（MBS）（图2F），提示VvWRKY72可能在植物对环境胁迫的响应中发挥调控作用。

 

 

2.3 VvWRKY72的组织特异性表达及其对低温、MeJA和灰霉菌的响应

qRT-PCR分析显示，VvWRKY72基因在鲜食葡萄品种‘玫瑰香’的所有测试组织中均有表达，在根、成熟果皮和成熟叶片中检测到较高的表达水平，而在幼叶、茎、芽、幼果和成熟果肉中表达水平较低（图3A）。这表明VvWRKY72可能在根、成熟果皮和成熟叶片中发挥重要作用。

为了研究VvWRKY72在植物胁迫响应中的作用，我们分析了其在非生物和生物胁迫下的转录水平。图3B展示了VvWRKY72对不同环境胁迫的多样化响应。在低温处理期间，VvWRKY72转录水平显著下调，在处理后1小时达到最低水平。相比之下，在MeJA和灰霉菌处理后，VvWRKY72表达显著上调，分别在处理后1小时和12小时达到峰值。与叶片中的表达模式一致，灰霉菌接种后葡萄果实中的VvWRKY72也显著上调（补充图1）。这些结果表明VvWRKY72可能参与植物对生物和非生物胁迫的响应。

 

 

2.4 VvWRKY72在拟南芥中的表达与亚细胞定位

为研究VvWRKY72的功能，我们通过农杆菌介导的花絮浸染法将p35S::VvWRKY72-GFP载体转入野生型拟南芥，获得T3代纯合转基因株系。通过半定量RT-PCR检测三个过表达株系（OE-4、OE-9和OE-11）中VvWRKY72的表达水平，均检测到明显的外源基因表达，而野生型（WT）中无表达（图4B）。使用共聚焦激光扫描显微镜观察转基因拟南芥幼苗根部的GFP荧光信号，结果显示VvWRKY72-GFP融合蛋白定位于细胞核（图4C），这与WRKY转录因子的亚细胞定位特征一致。

 

 

2.5 VvWRKY72过表达增强拟南芥对灰霉菌的敏感性

灰霉菌接种后，转基因拟南芥叶片表现出比野生型更严重的黄化和坏死病变（图5A）。在48和72小时post-inoculation（hpi），过表达株系的病斑直径显著大于野生型（图5B）。台盼蓝染色显示转基因叶片中细胞死亡区域明显更大（图5C）。进一步测定ROS相关指标：在72 hpi，转基因植株叶片中O₂⁻（通过NBT染色）和H₂O₂（通过DAB染色）积累显著增加（图6A），H₂O₂和MDA含量均显著高于野生型（图6B、6C）。同时，抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性在转基因植株中显著降低（图7A），其编码基因（AtCSD1、AtCSD2、AtCAT1、AtCAT2、AtCAT3、AtPOD2）的表达水平也显著下调（图7B）。这些结果表明，VvWRKY72过表达破坏了ROS稳态，加剧了氧化损伤和细胞死亡，从而增强了拟南芥对灰霉菌的敏感性。

 

 

2.6 VvWRKY72过表达抑制茉莉酸介导的防御

为探究VvWRKY72是否影响JA信号通路，我们检测了JA合成与响应相关基因的表达。灰霉菌接种后，野生型拟南芥中AtLOX3、AtAOC3、AtOPR3、AtOPR4、AtPDF1.2和AtPR3等基因的表达均显著上调，而在VvWRKY72过表达株系中，这些基因的上调幅度明显减弱（图8）。此外，转基因植株中CHI（几丁质酶）活性在接种后也显著低于野生型（补充图4）。

 

 

为验证VvWRKY72对JA通路的抑制作用，我们对外源MeJA处理的效果进行了评估。在灰霉菌接种前1小时喷洒50 μmol/LMeJA，结果显示：MeJA处理显著降低了野生型拟南芥的病斑直径（分别减少40.07%和37.67%），但对转基因株系的病斑大小无显著影响（图9A–9C）。同时，MeJA处理显著诱导了野生型中AtORA59、AtPDF1.2和AtPR3的表达，而转基因株系中这些基因的表达无明显变化（图9D）。以上结果表明，VvWRKY72的表达削弱了拟南芥中JA介导的防御，从而增强了对灰霉菌的敏感性。

 

 

2.7 VvWRKY72过表达抑制细胞壁相关防御

细胞壁和胼胝质沉积是植物抵御真菌入侵的关键初级防御机制。为探究VvWRKY72在细胞壁相关防御中的作用，我们检测了PCWDEs的活性。在灰霉菌接种前，转基因与野生型拟南芥中Cx、β-gal和PG的活性无显著差异（图10A）。但在接种后72小时，转基因植株中Cx、β-gal和PG的活性显著升高，而野生型中Cx和β-gal活性虽有所增加，但PG活性无明显变化。此外，XET活性在两者中均未改变。这些结果表明，VvWRKY72诱导的敏感性至少部分依赖于PCWDEs的活性升高。

灰霉菌接种后，叶片接种点周围均有胼胝质沉积，但转基因植株中的胼胝质沉积显著少于野生型（图10B）。这表明VvWRKY72过表达削弱了拟南芥的机械防御能力，使植物更容易受到灰霉菌的侵染。

 

 

2.8 VvWRKY72对葡萄抗灰霉菌的负调控作用

我们进一步通过农杆菌介导的瞬时转化探究VvWRKY72是否影响葡萄植株对灰霉菌的抗性。在农杆菌浸润后第3天，VvWRKY72过表达的葡萄叶片中VvWRKY72表达水平显著高于野生型和空载体对照（EV-OE）（图11A）。灰霉菌接种后48小时，叶片出现病斑；在72 hpi，VvWRKY72过表达叶片的病斑直径大于对照（图11B、11C）。台盼蓝染色显示过表达叶片中细胞死亡更明显（图11D）。在过表达叶片中，JA响应基因（VvERF020、VvERF098、VvPDF1.2、VvCHIT4）和抗氧化酶基因（VvSOD1、VvCAT1、VvPOD4）的表达下调，而编码PCWDEs的基因（VvBG1、Vvβ-gal10、VvPG、VvXTH32）表达上调（图11E–11G）。

 

 

相反，瞬时沉默VvWRKY72（图12A）的葡萄叶片在灰霉菌接种后病斑直径减小、细胞死亡减少（图12B–12D），同时抗氧化酶基因和JA信号组分基因表达上调，PCWDEs编码基因表达下调（图12E–12G）。综上所述，我们的证据表明VvWRKY72在植物防御灰霉菌过程中起负调控作用。

 

 

结论

 

总之，本研究首次提供了葡萄VvWRKY72转录因子在宿主响应灰霉菌感染中作用的新证据。生物信息学分析揭示了VvWRKY72特有的WRKY结构域，这是WRKY转录因子结合DNA所必需的结构。亚细胞定位和表达分析表明，VvWRKY72可能作为一个转录因子发挥作用。功能分析显示，过表达VvWRKY72会增强植株对灰霉菌的敏感性，同时伴随抗氧化和茉莉酸响应基因的下调、抗氧化酶活性降低、活性氧稳态失衡以及细胞壁相关防御的削弱。相反，沉默VvWRKY72则增强了葡萄叶片对灰霉菌的抗性。综合以上发现，表明VvWRKY72可能通过调控多条防御通路——包括ROS稳态、JA介导的防御以及细胞壁相关防御——来提高植物对灰霉菌的敏感性（图13）。未来的研究中，采用稳定的转基因株系或基因沉默突变体，结合转录组学和代谢组学等多组学分析，将对于阐明VvWRKY72的调控网络至关重要。