《中国酿造》：新疆农业大学杨兴元研究员等：吐鲁番葡萄沟产酯酵母的筛选及性能评价

新疆吐鲁番是我国重要的葡萄与葡萄酒产区之一，其独特的干旱气候与昼夜温差为葡萄栽培提供了优越的生态条件，同时孕育了多样的本土微生物资源。酵母菌作为果酒发酵的核心微生物，其代谢活动直接影响着发酵产品的品质与风味特征。其中，酯类化合物会赋予果酒更丰富的香气特征，是影响果酒风味品质的关键物质。酵母菌通过代谢调控酯类物质的合成与积累，进而影响产品的香气复杂度、口感及整体品质。因此，产酯酵母在果酒发酵中对于塑造产品的独特风味至关重要。

目前，果酒发酵常用的商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（如EC-1118、安琪系列、QA23等）具有稳定的发酵性能，但其同质化的代谢特征导致所酿葡萄酒缺乏地域特征和口味多样化。野生酵母在长期生态适应过程形成了与当地生态环境相匹配的代谢特征，不仅能够分泌多种水解酶（如β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶等），还能在发酵过程中合成丰富的酯类化合物（如乙酸乙酯、丁酸乙酯等），赋予产品独特的水果香、花香等怡人香气。因此，为改善葡萄酒品质，商业酵母往往与野生酵母搭配进行发酵。目前，非酿酒酵母与S.cerevisiae混合发酵已被多项研究证实可显著增强风味的多样性与复杂性。如在Petit Manseng白葡萄酒体系中，戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）与S.cerevisiae顺序发酵，显著提升了多种乙醇类物质，整体香气复杂度增强。在新疆以过熟的赤霞珠葡萄为原料，S.cerevisia和毕赤酵母（Pichia）混合发酵的赤霞珠葡萄酒中检出17种气味活性值（OAV）≥1的关键香气化合物，呈现果香、花香等特征。

目前，已有研究对吐鲁番地区的酵母资源进行了初步调查，该地区独特的生境可能蕴藏着具有特殊代谢特性的酵母菌株。吐鲁番葡萄沟位于吐鲁番火焰山西侧，栽培葡萄历史超2000年，为酵母资源提供理想场所。但针对吐鲁番葡萄沟这一特殊生态区域中酵母的多样性及其性能的研究较为有限，酵母资源尚未得到充分挖掘，以及对高糖、高乙醇等条件的耐受性能尚不明确。因此，新疆农业大学食品科学与药学学院的呙生婷、邓亚博和杨兴元*等从该地区分离、筛选优良产酯酵母，并评价其安全性、产酶特性及生长耐受性能，为挖掘本土特色微生物资源提供理论依据，并为今后进一步开展发酵实验、筛选适用于特色发酵食品的优良酵母菌种奠定初步的实验基础。

 

1 菌株的形态学特征及分子鉴定

 

采用梯度稀释法对吐鲁番葡萄沟土壤中的酵母菌进行分离筛选，初步在PDA平板上共挑取大小形态各异的235株酵母菌，部分菌株形态见图1。由图1可知，菌落大小从细小点状至中等菌落不等，颜色多呈乳白至米白色，少数为浅灰白或橙至砖红色，多数菌落表面光滑湿润、有光泽，形态以圆形或椭圆形为主。

将获得菌株的26S rDNA基因序列在NCBI网站进行序列比对，基于26S rDNA基因序列构建部分代表菌株的系统发育树，结果见图2。由图2可知，在葡萄沟土壤中分离的235株酵母，共涉及15个属。除Saccharomyces外，其余菌株均为非酿酒酵母。有孢圆酵母属（Torulaspora）、长西氏酵母属（Naganishia）、迈耶氏酵母属（Meyerozyma）和假丝酵母属（Candida）4个菌属占比分别是30.2%、21.7%、10.2%、10.2%，为该地区的优势菌群。且获得3株潜在新种TF8-3（98.74%）、TW1-01（96.47%）、TP6-1（98.65%），分别为Suhomyces、Torulaspora和Solicoccozyma属。

 

2 酵母菌发酵性能初筛结果

 

出于异味风险、香气能力与发酵力评估的综合考虑，将菌株产H₂S能力、产酯能力与产乙醇能力设为发酵性能初筛指标，共选取59株代表性非酿酒酵母菌株进行实验，结果见图3。

在酵母生长代谢过程中会产生具有臭鸡蛋、大蒜等味道的H₂S，以商业酵母为对照（呈深棕色），评估酵母菌株的产H₂S能力。由图3A可知，15株酵母菌落呈黑色或棕色，表现为高产H₂S；42株酵母菌落呈浅咖啡色，低产H₂S；2株酵母菌落呈白色，不产H₂S。表明多数菌株具备不同水平的H₂S生成能力。

优良的酵母菌株应具备产香的能力，因此需要对菌株进行产酯能力测定。由图3B可知，7株酵母菌落呈土黄色，具有高产酯能力；40株酵母菌落呈黄色，具有中产酯能力；12株酵母菌落呈白色，不具有产酯能力。

由图3C可知，14株酵母菌落呈红紫色，可判定为产乙醇能力较强；10株酵母菌落呈红色，可判定为产乙醇能力中等；35株酵母菌落呈浅粉色，可判定为产乙醇能力较低。

综合高产乙醇、低产H₂S、高产酯能力，最终筛选TF7-1、TF7-5、TG1-2等8株酵母菌进入后续试验。

 

3 酵母菌安全性评价结果

 

为确保食品发酵应用安全，对8株酵母菌开展安全性评价，结果见表1。由表1可知，8株酵母菌在吲哚试验、硝基还原酶试验和溶血性试验中的结果均为阴性。说明这些酵母菌未表现出与潜在致病性相关的关键特征，具有一定的安全性。

4 酵母菌产功能酶特性

 

为评估候选产酯酵母在风味与工艺上的潜力，对其功能酶进行初筛。选取与果酒密切相关的5类酶（蛋白酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶），将8株酵母菌分别点接至对应指示平板，以透明圈形成判定阳性，8株酵母菌的产功能酶活性结果见表2。

由表2可知，具有蛋白酶活性的酵母菌2株，具有淀粉酶活性的酵母菌6株，具有脂肪酶活性的酵母菌3株，具有果胶酶活性和β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌分别有5株。其中，菌株TF7-1、TF7-5、TF8-3、TW1-01及TW2-3均具备3种酶活性。菌株TF7-1和TF7-5在蛋白酶和脂肪酶活性方面表现突出，表明其可在酱油等发酵食品中进行应用。菌株TF8-3具有3种水解酶活性，表明其在果蔬加工等方面可能发挥多功能作用。菌株TW1-01和TW2-3在淀粉酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶活性方面表现突出，具有增强原料降解及提升其风味等能力的应用前景，适合应用于果酒酿造。

 

5 酵母菌耐受性评价结果

 

SO₂在果酒酿造过程中具有抑制杂菌的作用，但浓度过高可能会抑制酵母生长。为评估酵母菌株的SO₂耐受性，测定8株酵母菌在不同SO₂质量浓度下的生长情况（OD_600nm值），结果见图4A。由图4A可知，酵母菌株的生长随SO₂质量浓度增加而降低，但除菌株TF7-5生长显著受到抑制外，大部分菌株无明显差异。

果酒发酵过程中，有机酸形成的酸性环境可能影响酵母活性。酵母菌株pH耐受性结果见图4B。由图4B可知，当pH值为3.0和5.0时，大部分菌株生长旺盛，但少部分菌株生长情况较弱。当pH值达到1.0时，菌株生长受到明显抑制，菌株生长微弱（OD_600nm值＜0.5），菌株TW2-3和TW1-01在pH值3.0和5.0条件下表现出最佳生长能力，表明其对葡萄酒发酵的酸性环境具有较强适应性。

在发酵过程中，乙醇的持续积累会抑制酵母生长。酵母菌株乙醇耐受性结果见图4C。由图4C可知，随着乙醇体积分数的升高，酵母生长速率逐渐降低，但不同菌株的乙醇耐受性存在显著差异。当乙醇体积分数达到18%时，部分菌株仍能维持生长，表现出较强的乙醇耐受能力。其中，菌株TW2-3、TP1-03和TW1-01的耐受性最优，其在高乙醇体积分数（18%）条件下的生长表现显著优于其他菌株。

为探究高糖条件对酵母生长的影响，测定了8株酵母菌株在不同葡萄糖质量浓度下的生长情况（OD_600nm值），以分析其葡萄糖耐受性。由图4D可知，当葡萄糖质量浓度从50 g/L增至250 g/L时，OD_600nm值显著上升，表明葡萄糖作为碳源促进了细胞生长；但当葡萄糖质量浓度从250 g/L增至450 g/L时，OD_600nm值下降，说明过高浓度会抑制酵母生长。在葡萄糖质量浓度250 g/L条件下，酵母生长达到最佳状态。不同菌株的糖耐受性存在差异，其中菌株TW1-01和TW2-3表现最优。

 

6 讨论

 

研究发现，新疆葡萄酒重要产区之一的吐鲁番地区蕴藏着丰富多样的酵母资源。其中，Hanseniaspora、Saccharomyces、Naganishia、Candida 4个属在吐鲁番地区广泛分布。杨莹在鄯善县楼兰酒厂发酵汁中分离酵母菌218株，共涉及Hanseniaspora、Saccharomyces、Pichia等5个种属，其优势菌属是Hanseniaspora和Saccharomyces。徐建坤在吐鲁番、鄯善酒庄分离到92株酵母，共涉及Naganishia、Saccharomyces、Hanseniaspora、Candida等9个属，其优势菌属是Naganishia、Saccharomyces、Candida，分别占比17.4%、13%和10.9%。蔡燕丽等在吐鲁番地区葡萄园土壤中共分离13株酵母，共涉及棒孢酵母属（Clavispora）、Candida、隐球酵母属（Cryptococcus）等6个属，其优势菌属是Clavispora，占46.2%。

酵母在代谢过程中合成酯类化合物，如乙酰辅酶A与醇类的酯化反应生成芳香性化合物，赋予产品果香或花香等风味。因此，酵母产酯能力在食品发酵、酿酒、调味品等领域具有应用价值，受到广泛关注。曹恺欣在新疆、西藏等地区特色乳制品中共分离出产香酵母77株，其中NGD43（Torulaspora delbrueckii）产酶能力最强，能大量生成香气物质，如正戊醇、癸酸乙酯等，赋予酒体更多风味。梁斯梅在白酒样品中分离高产酯酵母菌Y4（Kluyveromyces marxianus），发现其对总酯、乙酸乙酯等风味物质有显著作用，使酒体米香味突出，品质得到提升。WANG X D等用Rhodotorula mucilaginosa和酿酒酵母进行混合发酵果酒，发现果酒中含26种酯类化合物，明显提高了酒体的口感，增强果酒的香味。

在果酒发酵中，优良的产酯酵母不仅具有产酯能力，还应具有较好的发酵性能及较强的耐受性，如耐高糖、耐乙醇、耐低pH等，在发酵中协同酿酒酵母起着提高发酵效率、提升产量等作用。周迪等在宁夏贺兰山产区筛选的本土野生酵母（Hanseniaspora、Metschnikowia、Starmerella）均可耐受（葡萄糖450 g/L，pH 1.0，SO₂ 250 mg/L，乙醇体积分数13%），不仅有优良的发酵性能，还产生了独特的香味物质，可用于酿造产区特色果酒。刘晓柱等从库尔勒香梨中分离的一株非酿酒酵母K6（Metschnikowia），通过耐受性分析发现菌株对乙醇浓度敏感，耐受于体积分数为9%的乙醇，在低酒精果酒生产上具有应用潜力。

 

7 结论

 

本实验从吐鲁番葡萄沟分离出235株酵母菌，含15个属，优势菌群为有孢圆酵母属（Torulaspora）、长西氏酵母属（Naganishia）、迈耶氏酵母属（Meyerozyma）和假丝酵母属（Candida），分别占比是30.2%、21.7%、10.2%、10.2%，其中发现3株潜在新种（TF8-3、TW1-01、TP6-1），分别属于Suhomyces、有孢圆酵母属（Torulaspora）和Solicoccozyma。通过产H₂S、产酯和产乙醇性能筛选及安全性评估，获得8株无致病性的优良产酯酵母。耐受性试验表明，戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）TW1-01和特立科拉毕赤酵母（Pichia terricola）TW2-03在250 g/LSO₂、450 g/L葡萄糖、18%乙醇及pH3.0条件下均生长良好，具备用于吐鲁番特色葡萄酒开发的潜力。后续将优化发酵工艺并研究其与商业酵母混合发酵效果。