J CLEAN PROD：生物动力与有机葡萄园管理对赤霞珠葡萄酒微生物群落及香气特征的影响

生物动力与有机葡萄园管理对赤霞珠葡萄酒微生物群落及香气特征的影响

期刊：Journal of Cleaner Production（9.8）

发表日期：2024年08月

 

 

研究摘要

 

近年来，科研人员与酿酒师愈发关注生物动力种植（BDN）和有机种植（ORG）的葡萄园管理模式，以期酿造出更具健康属性与地域特色的葡萄酒。然而，针对中国宁夏产区，生物动力、有机种植体系与葡萄酒微生物群落、酒体品质之间的关联性研究仍较为匮乏。本研究以宁夏产区赤霞珠葡萄为试验原料，分别选取生物动力葡萄园、生物动力邻近常规对照园、有机葡萄园、有机邻近常规对照园的酿酒葡萄，探究葡萄酒发酵过程中的微生物群落多样性及酒体挥发性香气物质差异。研究鉴定出3种优势真菌（Hanseniaspora uvarum、Cladosporium sp.与Alternaria alternata）和3种优势细菌（Lactobacillus kunkeei、Citrus maxima及Tatumella ptyseos）。研究发现，生物动力邻近常规对照园与有机葡萄园的真菌群落多样性显著高于生物动力葡萄园、有机邻近常规对照园。其中，生物动力邻近常规对照园的微生物互作网络结构最为复杂，具有最高的网络平均度、网络密度及较高的聚类系数。生物动力与有机葡萄园管理模式可赋予葡萄酒花香、草本香、香料香及清雅花香特征，同时降低酒体的温带水果香、热带水果香与浆果风味表达。种植体系、微生物群落与葡萄酒感官品质的关联分析表明，乳杆菌属乳酸菌在有机与生物动力酿酒体系中发挥关键作用，可提升葡萄酒感官品质与营养价值。此外，Nowamyces globulus、Hanseniaspora uvarum、Lactobacillus johnsonii、Fusarium sp.、Microterricola viridarii、Citrus maxima、Sphingomonas faeni、Cladosporium sp.、Cladosporium ramotenellum、Cladosporium cladosporioides、Kodamaea ohmeri及Lactobacillus plantarum均与葡萄酒香气物质呈显著正相关。本研究进一步明晰了葡萄园管理方式对微生物群落演替及葡萄酒品质特征的调控作用，为宁夏生物动力葡萄酒与有机葡萄酒产业的发展提供了理论参考与科学依据。

 

 

研究背景

 

随着居民生活水平的提升，生物动力葡萄酒、有机葡萄酒、生态可持续型葡萄酒及健康型葡萄酒愈发受到消费者青睐。生物动力葡萄酒与有机葡萄酒均以酿酒葡萄为原料，严格遵循有机种植和生物动力种植规范进行葡萄园管理。有机种植体系严禁使用人工合成化肥、杀虫剂、杀菌剂、除草剂及植物生长调节剂，葡萄产量调控与抗病能力主要依靠自然生态调节。生物动力种植则采用鲁道夫・斯坦纳（1861–1925）研发的专用发酵制剂，可促进土壤与葡萄植株间的养分循环，提升葡萄光合作用效率，同时推动土壤和农作物的堆肥腐熟进程。

葡萄酒发酵过程由细菌、酵母菌、丝状真菌等多种微生物构成的复杂动态微生物生态系统共同完成。葡萄表面及葡萄酒自然发酵过程中的微生物群落多样性，取决于葡萄生长环境与酿酒工艺，而树龄、葡萄园区位、葡萄园管理模式、葡萄品种、土壤及气候等因素，均会造成微生物群落结构产生差异。中国宁夏贺兰山东麓是国内酿酒历史悠久、发展潜力巨大的优质葡萄酒产区。该区域独特的气候特征与地理条件，经自然筛选孕育出丰富多样的微生物群落。葡萄园与酒庄环境中特有的本土微生物，在发酵过程中发挥重要作用，能够赋予葡萄酒鲜明的地域特色。已有研究显示，有机种植和生物动力种植葡萄表面的本土微生物，与常规种植葡萄的微生物群落存在差异，而这类微生物对葡萄酒品质的影响仍有待深入研究。目前关于有机与生物动力葡萄酒的研究，多采用依赖培养法，即通过培养基分离鉴定微生物，探究微生物多样性及其与酵母群落动态、葡萄酒感官特征的关联。基于高通量测序的非培养法可全面解析微生物群落组成，但相关研究仍有待进一步补充完善。

本研究旨在探究葡萄园管理方式对微生物群落多样性及葡萄酒风味的影响，筛选菌种构建酵母菌种资源库，保护本土酵母遗传资源，为生物动力葡萄酒与有机葡萄酒产业的进一步发展提供研究思路与理论支撑。

 

结果与讨论

 

2.1.葡萄园选择

2020年，研究选取两座葡萄园开展试验，分别为生物动力管理葡萄园（BDN，东经106°26′、北纬38°31′）与有机管理葡萄园（ORG，东经106°27′、北纬38°06′），旨在探究上述管理模式对葡萄酒风味及微生物群落的影响。为最大限度降低葡萄生长环境差异带来的干扰，本研究选取紧邻生物动力园的常规对照园（BDNc）、紧邻有机园的常规对照园（ORGc）作为对照组，四个葡萄园风土条件一致，葡萄树龄相近，且均为赤霞珠品种。

 

2.2.葡萄酒发酵与微生物采样

 

2.3.高通量测序分析

 

2.4.葡萄酒挥发性化合物分析

 

2.5.感官分析

 

2.6.数据分析

 

结果与讨论

 

3.1.葡萄园种植方式对葡萄及葡萄酒基础品质特征的影响

本研究通过每日称量失重监测葡萄酒发酵进程，葡萄酒CO2失重变化如图1所示。所有酒样均在发酵第3天启动发酵，其中有机组酒样发酵进程最为缓慢，直至第13天仍保持最慢发酵速率。生物动力组酒样发酵速度最快，自第6天起失重速率大幅放缓，表明生物动力组葡萄酒发酵已基本完成。各处理组发酵均进行完全，所有酒样均属于干型葡萄酒（残糖含量＜4 g/L）。有机组与有机对照组葡萄酒的总酸含量显著高于生物动力组与生物动力对照组葡萄酒。

 

 

酒精发酵不同阶段的酵母群落演替（相对丰度＞1%）结果如图2及附表1所示。生物动力对照组样品的酵母群落多样性高于生物动力组。发酵第0天时，生物动力组检出13种酵母，生物动力对照组检出14种酵母。发酵过程中，两组酵母属数量分别由13个降至8个、由14个降至9个。Hanseniaspora uvarum与Metschnikowia在生物动力组及生物动力对照组发酵全过程中均有检出。Cyberlindnera bimundalis、Kluyveromyces marxianus、Lodderomyces elongisporus、M. pulcherrima、Meyerozyma caribbica及Wickerhamomyces anomalus在发酵第6天和第8天均未检出，说明这类酵母对乙醇胁迫的耐受能力较弱。值得注意的是，Hanseniaspora uvarum在生物动力组中始终为优势菌种（图2A），其相对丰度由发酵第0天的90.68%逐步升至第8天的99.11%，而在生物动力对照组中，该菌丰度由第0天的94.91%降至第2天的25.57%，随后又逐步回升至第8天的95.67%。本研究结果与团队前期采用传统培养法得到的结论存在差异，前期研究发现Hanseniaspora uvarum仅在发酵初期（第0、2天）占优势，发酵后期（第4、6、8天）则由酿酒酵母成为优势菌群。Candida parapsilosis、M. pulcherrima、Saccharomycopsis fibuligera、Starmerella bacillaris仅在生物动力组样品中检出；而Kluyveromyces marxianus、Lodderomyces elongisporus仅在生物动力对照组样品中检出。

 

 

研究发现，Hanseniaspora uvarum与Metschnikowia在有机组和有机对照组样品中同样全程检出，Issatchenkia orientalis、Kazachstania humilis及Pichia sp.在两组发酵各阶段均广泛分布（图2B）。整体来看，Hanseniaspora uvarum为绝对优势菌种，仅在有机组发酵第6天以Kazachstania humilis占主导（相对丰度75.07%）、有机对照组发酵第0天（84.86%）与第8天（85.59%）由Kazachstania humilis占据优势。与有机对照组相比，有机组在发酵第0天和第8天酵母物种更丰富（均检出10种），在第4天、第6天酵母多样性更低（分别检出8种、9种）。此外，Cyberlindnera bimundalis、Dekkera bruxellensis、Kluyveromyces marxianus、Kodamaea ohmeri、Lodderomyces elongisporus及Wickerhamomyces anomalus均未在有机组与有机对照组样品中检出。

 

3.2.葡萄园管理模式对微生物群落的影响

本研究采用高通量测序技术，分析不同酿酒处理组间微生物群落多样性的差异。共鉴定出真菌12门、47纲、102目、226科、369属、580种，细菌26门、56纲、137目、212科、387属、190种。发酵五个时期真菌与细菌的物种观测数、香农多样性指数等α多样性指标结果见图3A-D。细菌群落整体多样性呈先下降后上升趋势，生物动力对照组在发酵第8天达到多样性峰值，发酵第4、6天，其细菌多样性与有机对照组、生物动力组差异显著，第8天则与有机对照组、生物动力组、有机组均存在显著差异（图3A）。除发酵第2天外，生物动力对照组与有机组的真菌物种数量显著高于生物动力组和有机对照组（图3B），有机组真菌群落的物种数在发酵第4天出现明显上升。生物动力组与生物动力对照组的细菌香农多样性指数显著高于有机组与有机对照组，说明生物动力种植体系及其对照园区的细菌群落丰富度优于有机种植体系（图3C）。而在同一发酵时期，有机组、有机对照组、生物动力组、生物动力对照组四组样品的真菌Shannon diversity指数无显著差异（图3D），表明葡萄园管理模式并未对真菌群落多样性产生不利影响。

 

 

本研究选取丰度排名前15的微生物类群，从物种水平解析真菌与细菌的群落演替特征。在细菌群落中，Lactobacillus kunkeei、Citrus maxima、Tatumella ptyseos是有机组、有机对照组、生物动力组、生物动力对照组整个发酵过程中的三大优势菌种（图4A）。Citrus maxima在有机对照组和生物动力对照组发酵全程均为优势细菌，Tatumella ptyseos在生物动力组发酵第3天、第5天丰度最高，Lactobacillus kunkeei则在有机组发酵第2、3、5天占绝对优势。值得注意的是，T. ptyseos在生物动力组所有发酵阶段均有检出，而仅存在于其他处理组发酵初期（第0天、第2天）。与之相反，Lactobacillus johnsonii和Hydrogenophilus thermoluteolus未在葡萄发酵初始阶段（第0天）检出，但参与了后续发酵进程。

在真菌类群中，Hanseniaspora uvarum、Cladosporium sp.、Alternaria alternata为发酵过程中的三大优势物种（图4B）。其中Cladosporium sp.在大部分发酵阶段均占据优势。Kodamaea ohmeri与Dekkera bruxellensis仅在生物动力组、生物动力对照组样品中检出，在有机组与有机对照组中其生长受到抑制。

 

 

3.3.不同微生物间共现与互斥关系分析

本研究构建细菌-真菌跨界共现网络，分别分析不同葡萄园管理模式下微生物物种的共存特征。结果表明，生物动力组、生物动力对照组、有机组、有机对照组的微生物网络复杂度差异显著。生物动力对照组与有机组的微生物网络结构更为复杂，拥有更多节点数（分别为867个、885个）、互作关联数（分别为38303条、16675条）以及更高的平均度（分别为88.358、37.687）（图5B、图5C及表1）。生物动力组和有机对照组的模块度分别高于生物动力对照组和有机组，说明生物动力组与有机对照组的微生物网络具备模块化结构与小世界网络特征。生物动力对照组的网络复杂度最高，拥有最大的平均度与网络密度，同时聚类系数也处于较高水平（图5B及表1）。

 

 

本研究中的关键菌群，细菌主要归属于Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria和Actinobacteriota，真菌主要归属于Ascomycota和Basidiomycota。且不同葡萄园管理模式下，微生物网络中的关键物种存在明显差异。针对图4A、图4B中丰度前三的细菌和真菌物种可以发现真菌大多与其他微生物类群呈正相关，而细菌整体多表现为负相关。在生物动力组中，Hanseniaspora uvarum与Cladosporium sp.呈负相关，说明Cladosporium sp.可能抑制该酵母菌的生长。在生物动力对照组与有机对照组中，Cladosporium sp.与Alternaria alternata呈正相关。在有机组和生物动力对照组中，Lactobacillus kunkeei与Tatumella ptyseos呈正相关，与Citrus maxima呈负相关。

 

 

3.4.葡萄园管理模式对葡萄酒香气的影响

本研究共检出40种挥发性香气物质，包含13种醇类、20种酯类、4种有机酸类及3种其他化合物。各类香气物质的香型、含量、香气阈值及感官特征见表2。同时通过聚类分析筛选特征香气物质，用以区分不同葡萄园管理模式酿造的葡萄酒（图6）。聚类分析结果显示，相同葡萄园管理模式的样品可聚为同一类群，有机组与生物动力对照组样品聚类距离更近，生物动力组则与有机对照组样品聚类关系更为相近。

 

 

 

生物动力组葡萄酒中有9种挥发性香气物质含量显著高于生物动力对照组，同时有13种物质含量显著更低（表2）。在生物动力组占优势的9种挥发性物质中，苯乙醇、异丁醇、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯、异丁酸共5种物质的气味活性值（OAV）大于1。对于有机组与有机对照组葡萄酒，有机组有13种挥发性物质含量显著高于有机对照组，仅3种物质含量显著更低。在有机组占优势的13种挥发性物质中，苯乙醇、1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、辛酸乙酯、异丁酸5种物质气味活性值均大于1，可赋予葡萄酒花香、果香、蘑菇香与脂香风味。此外，3-甲基-1-戊醇、顺-3-己烯-1-醇、琥珀酸二乙酯的气味活性值在四种发酵处理组葡萄酒中存在明显差异（表2）。其中仅某组酒样中3-甲基-1-戊醇的气味活性值处于0.1~1区间，其余酒样均低于0.1。整体而言，有机与生物动力葡萄园管理模式可赋予葡萄酒更突出的玫瑰花香及脂类香气特征。

 

 

3.5.微生物群落与挥发性香气物质的关联

葡萄酒的香气品质与饮用安全性，和发酵过程中的微生物生态、微生物代谢产物的种类及浓度密切相关。为探明不同发酵体系中核心微生物与香气物质间的内在联系，本研究选取丰度排名前10的真菌属、前10的细菌属，以及11种气味活性值大于1的特征香气物质开展相关性分析，并通过相关性图谱进行可视化表达（图7A–D）。生物动力组、生物动力对照组、有机组、有机对照组分别检出6种、2种、5种、1种与香气物质呈显著正相关的关键微生物，涵盖Nowamyces globulus、Hanseniaspora uvarum、Lactobacillus johnsonii、Fusarium sp.、Microterricola viridarii、Citrus maxima、Sphingomonas faeni、Cladosporium ramotenellum、Cladosporium sp.、Cladosporium cladosporioides、 Kodamaea ohmeri、Lactobacillus plantarum，说明真菌与细菌均在葡萄酒香气形成过程中发挥重要作用。

在上述关联关系中，仅在有机对照组检出的Nowamyces globulus与β-大马士酮呈显著正相关（图7D），可赋予葡萄酒蜜桃罐头、烤苹果、西梅干类香气。此外，Sphingomonas faeni、Hanseniaspora uvarum分别在生物动力对照组、有机组发酵体系中与β-大马士酮显著相关（图7B、C）。Fusarium sp.在生物动力对照组中与异丁酸香气相关，在有机组中与乙酸乙酯香气相关（图7B、C）。同时本研究发现，Citrus maxima在有机组中与乳酸异戊酯显著相关，目前尚无文献报道该菌株对葡萄酒香气的调控作用，仍有待后续研究补充。

除此之外，乳杆菌属乳酸菌在生物动力与有机酿酒体系中同样起到关键作用，能够改善葡萄酒感官风味并提升营养价值。本研究发现，Lactobacillus plantarum、Lactobacillus johnsonii分别与苯乙醇、乙酸乙酯呈正相关（图7A、C）。在生物动力组中，苯乙醇与Microterricola viridarii、Kodamaea ohmeri、Lactobacillus plantarum均呈显著正相关（图7A），表明这类微生物可有效塑造葡萄酒风味。

 

 

3.6.不同葡萄园管理模式葡萄酒的感官评价

为系统对比不同葡萄园管理模式下葡萄酒的感官风味差异，邀请15名行业专业人员开展盲评感官试验，葡萄酒香气特征描述词参照戴维斯香气轮盘筛选确定（图8，附表4）。感官评价结果显示，不同管理模式葡萄酒的整体香气轮廓相近，但各类香气的浓郁度存在显著差异。与其他酒样相比，生物动力组葡萄酒的花香、草本香与香料香更为突出，有机组葡萄酒呈现中度清雅花香，温带水果香、热带水果香及浆果香浓郁度均低于其余酒样。

 

 

结论

 

本研究以生物动力、有机两种生态可持续葡萄园管理模式，及其各自邻近常规对照园的赤霞珠葡萄所酿葡萄酒为研究对象。结果表明，葡萄园管理方式可显著改变微生物群落演替规律与葡萄酒香气特征。生物动力对照组与有机园的真菌群落多样性显著高于生物动力园与有机对照园，四种管理模式下微生物群落共现网络的结构复杂度差异明显。Nowamyces globulus、Hanseniaspora uvarum、Lactobacillus johnsonii、Fusarium sp.、Microterricola viridarii、Citrus maxima、Sphingomonas faeni、Cladosporium sp.、Cladosporium ramotenellum、Cladosporium cladosporioides、Kodamaea ohmeri、Lactobacillus plantarum均与葡萄酒香气物质呈显著正相关。乳酸菌在生物动力与有机葡萄酒酒精发酵全程发挥重要功能，有效提升了葡萄酒的感官品质与营养特性。生物动力管理模式可赋予葡萄酒浓郁的花香、草本香与香料香；有机管理模式葡萄酒呈现中度花香，温带果香、热带果香及浆果香风味偏弱。

本研究证实，产区环境与葡萄园管理方式会显著重塑葡萄园微生物生态结构，进一步佐证了微生物风土效应与葡萄酒风味、品质密切相关的学术观点，也为深入揭示葡萄园管理模式对微生物群落动态演替及葡萄酒品质的影响机制提供了理论支撑。