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Metab. Eng.：机器学习驱动代谢平衡优化解脂耶氏酵母β-胡萝卜素合成
发布时间：
2026-08-08
来源：
葡萄研究
机器学习驱动代谢平衡优化解脂耶氏酵母β-胡萝卜素合成
期刊：Metabolic Engineering（7.8）
发表日期：2026年
研究摘要
平衡代谢通路是构建高效、稳定微生物底盘细胞合成高附加值生物产品的核心关键。在改造用于生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母中，脂质合成既能作为类胡萝卜素储存载体，又会与β-胡萝卜素合成竞争共有碳前体乙酰辅酶A，细胞资源分配失衡会大幅限制产物合成效率，亟需精准调控通路通量分配。本研究搭建一套机器学习计算框架，量化解析甲羟戊酸通路、脂质合成通路、β-胡萝卜素合成基因簇三大核心代谢模块间复杂互作关系；该计算模型可基于基因整合拷贝组合预测β-胡萝卜素产量，指导多轮迭代基因整合策略，实现通路网络全局优化。依托该框架，经9轮机器学习指导的基因整合改造，最优工程菌株YLT226的β-胡萝卜素滴度较初始出发菌株YLT001提升7倍。本工作为解析、重构微生物代谢通量分布提供了普适性机器学习工程策略，为类胡萝卜素及其他萜类天然产物细胞工厂构建提供了新思路。
研究背景
生物经济依托可再生生物资源生产食品、能源与工业原料，代谢工程是实现生物制造可持续转型的核心技术手段，通过基因敲除、过表达重定向微生物代谢流，高效合成生化产品、生物燃料与生物材料。传统代谢工程多聚焦单一通路关键基因修饰，却忽略代谢网络内部高度耦合、非线性互作特征，极易引发代谢失衡、产物得率下降、通路间资源权衡等问题，成为制约高效细胞工厂构建的核心瓶颈。
解脂耶氏酵母天然具备极强油脂积累能力，胞内乙酰辅酶A储备丰富，是β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄质等类胡萝卜素理想合成底盘。脂质体可为疏水性β-胡萝卜素提供储存基质，促进产物胞内富集；但脂质合成与β-胡萝卜素合成共享关键前体乙酰辅酶A，二者存在直接碳流竞争，形成独特的双重代谢关系：脂质适度合成提升产物储存能力，过量脂质合成则分流前体碳流、抑制β-胡萝卜素生成，这种协同与竞争并存的权衡关系，无法依靠传统试错式基因改造实现最优调控。
现有通路平衡优化手段多依赖启动子强度微调、基因拷贝数分步改造，流程耗时、改造结果不可预测，难以量化通路间竞争与协同强度；经典试验设计（DoE）仅适配规则化因子试验，无法适配迭代基因组整合带来的非规则、离散基因拷贝数据集。近年来机器学习逐步应用于代谢工程预测基因拷贝适配性，但现有模型仅适用于线性合成通路，无法表征同一通路兼具竞争、协同双重功能的复杂代谢场景。针对解脂耶氏酵母中脂质通路与类胡萝卜素通路的矛盾关系，亟需开发可量化非线性代谢互作的机器学习框架，将试错型代谢工程转化为可预测、定量指导的系统工程手段，为多耦合通路协同优化提供标准化解决方案。
研究内容
1. 培养条件与培养基
2. 质粒与菌株的构建
3. Cre-loxP系统对辅助营养标志物的管理
4. 单胞拉曼光谱
5. 细胞内代谢物的定量
6. 自助统计分析
7. 瓶中β胡萝卜素的生产
8. 类胡萝卜素和脂质的定量
9. 特征工程
10. 模型开发与选择
11. 应变设计预测与验证
12. 代谢关系分析
研究结果
1. 通过增强MVA途径和β类胡萝卜素合成簇过表达来改善β类胡萝卜素的生成
以无类胡萝卜素合成能力的PO1f构建初始菌株YLT001（仅导入β-胡萝卜素合成簇），基础滴度192.7 mg/L；过表达高效粪肠球菌来源MVA通路基因MvaE/MvaS得到YLT101，前体供给增强使产量提升41.5%至272.6 mg/L；连续三轮强化β-胡萝卜素合成簇（C值提升）获得YLT104，产量达549.3 mg/L，较初始菌株提升3倍。碳氮比梯度试验显示，碳氮比升高会引导碳流向脂质、抑制菌体生长，β-胡萝卜素仅在C/N=30时达到细胞干重占比峰值6.11%，单纯调控培养条件无法大幅突破产物合成上限，证实必须通过基因改造平衡通路通量。
2. 上调脂质水平以促进β类胡萝卜素积累
在YLT105基础上整合脂质合成基因ACC1/DGA构建YLT115，宏观摇瓶结果显示脂质总量提升31.2%，β-胡萝卜素产量提升24.7%至798.3 mg/L，统计学t检验差异显著（p＜0.05）。单细胞拉曼光谱显示，YLT115全细胞β-胡萝卜素、脂质特征峰强度显著高于对照；594个单细胞相关性分析得出脂质与β-胡萝卜素胞内含量强正相关（R²=0.83），种群分布整体向高脂质、高产物区间偏移，证明脂质体是β-胡萝卜素储存关键载体。
多梯度脂质整合菌株时序培养结果揭示权衡阈值：随脂质整合轮次提升（YLT105→YLT115→YLT125），β-胡萝卜素持续上升，但继续强化脂质通路至YLT135后，产物产量不再提升；生长周期代谢流动态显示，对数期细胞优先积累脂质，碳源限制阶段脂质降解释放乙酰辅酶A供给β-胡萝卜素合成；当脂质合成强度超过临界阈值，前体竞争效应完全抵消储存协同增益，证实单一通路无限制过表达存在固有缺陷，必须精准平衡三大模块。
3. 利用特征工程驱动的机器学习框架
特征工程将3维基础特征拓展至27维后，模型性能实现跨越式提升：训练集R²由0.88提升至0.96，MAE下降48%、RMSE下降46%；针对未参与训练、总整合轮次为10的全新菌株独立测试集，预测MAE从231.69降至28.15，预测误差降低87.8%。对220组理论基因组合预测后筛选4株最优菌株，发酵实测值与模型预测值误差仅0.3%–3.7%，预测可靠性极高；即使对超出训练集上限（总整合轮次12）的菌株YLT228，模型预测误差仅8.1%，具备一定外推能力。
数据集梯度缩减试验证明，仅19株策略性设计菌株（总整合轮次≤7）即可实现预测误差＜5%，无需构建数十株工程菌株，大幅缩减代谢工程迭代试验成本；特征重要性排序显示，三通路交互项A×B×C、双通路交互项B×C、A×C贡献权重显著高于单一通路A、B，说明通路间互作是决定产物产量的核心变量，而非单一通路拷贝数。
4. 通过特征重要性分析解码路径交互
分层线性回归模型定量拆解脂质通路双重作用：脂质通路B单独作用系数为-227（显著负相关，代表前体竞争），但B×C交互项系数为+54、A×C交互项系数+17（显著正相关，代表储存、前体协同增益）；方差分析证实引入B×C交互项后模型拟合度极显著提升（F=9.11，p=0.0029），直接解释脂质通路“竞争与促产并存”的矛盾现象。三元相图可视化全部220组预测数据，β-胡萝卜素高产仅集中在狭窄“最优平衡区间”，不存在单通路最大化高产组合；最优基因整合分配规律为：β-胡萝卜素合成簇整合轮次为MVA通路+脂质通路总轮次的1.5–2.5倍，优先平衡脂质-类胡萝卜素双模块互作，其次优化前体供给通路匹配度。经9轮机器学习指导的分步整合改造，最优菌株YLT226产量突破1300 mg/L，相较初始菌株YLT001实现7倍产量提升，验证框架实际改造价值。
5. 研究局限性与拓展方向
本体系存在三点明确局限：其一，训练数据集仅28株菌株，总整合轮次上限为10，未纳入整合位点、启动子强度、基因表达时序变量，无法解析基因组插入位置带来的表达波动；其二，模型仅采用基因整合轮次作为输入特征，未引入酶动力学参数kcat、Km，难以表征限速酶动力学约束；其三，所有验证均在标准YPD摇瓶完成，未探究发酵pH、溶氧、工业放大等环境变量对模型预测的干扰。
后续拓展思路分为三方面：结合转录组、代谢组多组学数据扩充特征维度，纳入胞内调控、代谢负担相关特征；耦合动态代谢模型实现时序表达精准调控；将框架推广至戊糖磷酸途径供NADPH、多萜类合成等存在资源权衡的代谢体系，拓展机器学习代谢工程通用场景。
研究结论与意义
解脂耶氏酵母脂质通路存在双重代谢效应：单独上调脂质合成会与β-胡萝卜素竞争乙酰辅酶A，抑制产物合成；脂质与β-胡萝卜素通路协同强化时，脂质储存作用可促进产物积累，但二者存在定量平衡阈值，突破阈值后竞争效应占优。本研究构建特征工程SVR机器学习模型，能够有效刻画代谢网络中的竞争、协同与饱和非线性关系，相比基础特征模型预测误差下降87.8%，仅19株菌株即可完成高精度训练，降低改造试验成本。萜类细胞工厂不宜单一通路强过表达，高产区域位于多通路通量配比的狭窄平衡窗口；最优调控方案为β-胡萝卜素合成模块整合强度为前体与储存通路总强度的1.5–2.5倍，脂质-类胡萝卜素互作对产量的调控作用显著高于前体-类胡萝卜素互作。借助模型指导迭代改造，最优菌株YLT226 β-胡萝卜素产量相比初始菌株提升7倍，模型具备外推能力，对训练集范围外菌株产量预测误差低于10%。
理论层面，本研究摒弃单一通路最大化改造思路，构建系统通量平衡定量代谢工程理论，量化解析通路兼具竞争、协同的双向代谢权衡，多尺度阐明解脂耶氏酵母类胡萝卜素调控机制，完善萜类合成理论，建立多耦合通路通量解析定量范式。
应用层面，该技术大幅减少工程菌株构建数量，缩短细胞工厂开发周期；所得高产菌株β-胡萝卜素滴度突破1300 mg/L，依托食用酵母底盘助力绿色生物合成，替代化学合成路线。同时该机器学习优化框架具备良好普适性，可推广至多种高附加值天然产物合成体系，推动微生物代谢工程由经验试错转向计算驱动的精准改造。
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