Food Chem：非靶向挥发性轮廓分析探究葡萄酒口腔加工过程中香气物质的转化规律

非靶向挥发性轮廓分析探究葡萄酒口腔加工过程中香气物质的转化规律

期刊：Food Chemistry（10.4）

发表日期：2023年3月

 

 

研究摘要

 

本研究结合非靶向挥发性轮廓分析与吐样香气检测法（SOOM），探究口腔加工及人体内在生理变量如何改变整体挥发性组分，以此解析葡萄酒入口后香气物质的变化归宿。采用气相色谱飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分别检测未入口原红酒、经口腔处理后的吐出酒样、空白吐水对照组，尽可能全面识别样品中所有挥发性物质。研究鉴定出吐出酒样中来源于人体内源、外源的口腔衍生化合物，证实唾液酶可对香气物质发生代谢转化。数据证明口腔内会通过水解反应生成新挥发性产物，同时提供口腔中转酯反应生成全新香气物质的实验依据。在探究人体内在生理变量的影响时，本研究发现年龄、性别会造成葡萄酒经口腔加工后挥发性组分存在特异性差异，并筛选出介导该差异的关键挥发性物质。

 

研究背景

 

葡萄酒入口后，口腔加工会通过多重机制改变香气组成，包括香气与唾液发生稀释、香气结合唾液蛋白、香气吸附于口腔上皮细胞及口腔微生物相互作用等。已有大量研究证实，香气物质可在口腔内代谢转化为其他衍生物，甚至能由无香气前体生成全新香气分子。参与香气体内代谢的关键因素包括口腔微生物群落、唾液腺与口腔上皮细胞分泌的各类酶。

年龄、性别、种族等个体固有生理特征会改变口腔生理指标，进而影响葡萄酒入口后的香气代谢。该差异源于唾液分泌量、唾液总蛋白含量等口腔生理特征不同，直接改变口腔内香气释放动态。除唾液稀释、蛋白结合等作用外，不同年龄-性别人群口腔内香气代谢能力不同，是造成香气释放差异的核心原因。现有研究中唾液多数挥发性物质属于外源物质，例如大气污染物、日化护理产品残留、饮食残渣、口腔初步消化产物等，关于年龄、性别如何通过口腔加工改变唾液挥发性组分的相关研究十分匮乏。

现有多种技术可用于探究口腔组分对葡萄酒香气的影响，吐样香气检测法（SOOM）是主流手段，可通过对比原酒与吐出混合液（葡萄酒+唾液）的挥发性图谱，定量香气在口腔中的吸附与流失。借助该技术测得，香气物质在口腔黏膜吸附率介于6%~43%，吸附强度由香气分子自身性质决定。尽管SOOM技术可以解析葡萄酒香气在口腔的吸附、释放规律，但过往相关研究均仅在添加少数单一香气的模拟酒体系开展，无法复刻真实葡萄酒复杂香气种类与浓度，且配套检测多采用靶向气相色谱质谱，仅定量少数几种主体香气，大量低 浓度但对风味至关重要的香气及其代谢产物被忽略。

 

材料与方法

 

2.1.葡萄酒

2014年橡木陈酿商业干红，以丹魄（84%）为主，格拉西亚诺葡萄（9%）、马苏埃罗葡萄（5%）以及加尔纳恰葡萄（2%）。酒样pH值为3.73±0.03，乙醇含量14% (v/v)，总多酚1656±85 mg gallic acid/L，总原花青素962±11 mg catechin/L，中性多糖4033±716 mg mannose/L，游离氨基酸358±18 mg leucine/L，而游离氨基酸加上肽的总含量则达到 461±137 mg leucine/L。

 

2.2.受试者

共计32名志愿者，分为青年组（＜35岁，男女各8人）、老年组（＞55岁，女性7人、男性9人），根据性别将参与者分为两组。在招募志愿者时排除了口腔疾病、酒精禁忌、孕期人群，实验前禁食禁饮1小时。

 

2.3.样品采集

1. 每名受试者先使用矿泉水漱口，收集清水吐出液作为空白对照；

2. 取15 mL葡萄酒含漱30 s后吐出，重复3次获得3份葡萄酒口腔吐出液，组间间隔15 min，间隔期用果胶水溶液（1 g/L）+清水清洁口腔消除残留干扰；

3. 吐出样品立刻添加氯化钙终止唾液酶促反应，所有样品- 80℃冷冻保存。

 

2.4.GC-TOF-MS非靶向挥发组学检测

 

结果与讨论

 

3.1.非靶向挥发性组分数据整体概况

采用标准非靶向挥发性物质分析流程对原始数据预处理后，在全部样品（市售原葡萄酒、清水吐出液、葡萄酒吐出液、混合质量控制样品）中共检出1770个特征峰。本研究遵循标准非靶向挥发性物质分析流程，最终将有效特征峰精简至248个。

248个特征峰中，245个在质控样品中检出，183个在对照组（清水吐出液）检出，248个全部存在于葡萄酒吐出液，215个存在于原葡萄酒。基于248个特征峰开展主成分分析（PCA），区分清水吐出液、葡萄酒吐出液与质控样品。如图1所示，第一主成分（PC1，总方差72.2%）、第二主成分（PC2，总方差13%）、第三主成分（PC3，总方差3.9%）累计可解释89.1%的总变异。不同类型样品在图1a中呈现明显分离趋势，PC1将图谱右侧的葡萄酒吐出液、质控样品与左侧清水吐出对照组完全分开。大量特征峰与PC1呈正相关，因子载荷大于0.1，其中10种已初步定性的核心物质为对羟基苯甲酸乙酯、酪胺衍生物、未知化合物（P1413_RT2350.6_mz100.1）、2-甲基丁酸、琥珀酸甲乙酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、异戊酸、5-氧代-DL-脯氨酸乙酯、4-乙基苯酚。

 

 

另有部分特征峰与PC1负相关，代表性物质为多种烷烃（P1136_RT2008.7_mz57.1、P0981_RT1825.9_mz57.1、P0271_RT684.9_mz57.1、P0497_RT1075.4_mz57.1）与二甲基砜。样品间的分离规律源于葡萄酒吐出液、质控样品中绝大多数挥发性代谢物含量显著高于清水对照组。图1b为PC1与PC3联合绘制的PCA双标图，PC3可清晰区分原葡萄酒与葡萄酒吐出液样品。其中，2-甲基-1-丁醇、泛解酸内酯、3-羟基苯甲酸乙酯与PC3呈负相关（因子载荷＜-0.134），1种直链烷烃（P0144_RT451.1_mz57.1）与2种支链烷烃（P0263_RT669.6_mz71.1、P0578_RT1189.6_mz57.1）与PC3呈正相关（因子载荷＞0.163）。

由图1可见，质控样品、原葡萄酒、葡萄酒吐出液聚集在同一区域，而对照组（唾液+清水）样品单独聚类。这表明葡萄酒吐出液的挥发性组分主要受原葡萄酒风味物质主导，唾液内源挥发性物质的干扰相对较弱。相较于葡萄酒吐出液与对照组，质控样品聚类更加紧密，说明不同上机时间带来的检测波动极小。

 

3.2.口腔处理引发葡萄酒挥发性物质的变化

本实验选用挥发性组分复杂的市售葡萄酒，对比原葡萄酒与葡萄酒吐出液中各挥发性特征峰的含量差异，探究口腔处理的作用效果。同时采用相同方法检测葡萄酒漱口前收集的清水吐出液，以此证明观测到的组分变化确实由葡萄酒的口腔代谢过程导致。表1列出99种初步定性的特征物质，这些物质在原葡萄酒、清水对照组、葡萄酒吐出液三组样品中的相对含量均存在显著差异。

如表1所示，共有49种挥发物在葡萄酒吐样与清水空白中丰度无显著差异，另有12种物质在清水空白中的丰度显著高于葡萄酒、葡萄酒吐样。以上合计61种化合物在饮用葡萄酒前口腔内已有同等甚至更高浓度，因此葡萄酒吐样中检出该类物质不能归因于葡萄酒组分在口腔内的代谢，其来源大概率为唾液或日化、护理产品残留。这61种物质经初步定性，分属多个化学类别：42种烷烃、3种酮（2-哌啶酮、3-庚酮、二甲基砜）、2种醇（二十烷醇、2-甲基-2-丁烯-1-醇）、2种酯（硬脂酸异丁酯、硬脂酸丁酯）、1种醛（壬醛）、1种含氮杂环（吲哚），以及10种未知物质（表1）。有18种挥发物在原酒中丰度显著高于葡萄酒吐样、清水空白（p＜0.05），其中12种在清水空白中完全未检出，说明品酒前口腔不含该类物质，仅来源于葡萄酒，剩余6种在空白中仅有微量检出。葡萄酒吐样中这类物质丰度下降存在两种成因：一是口腔稀释作用；二是唾液、口腔黏膜中的酶将其代谢消耗。酶促反应会减少底物含量，同时生成新挥发性产物。

 

 

对比三类样品挥发谱发现，共16种特征峰在葡萄酒吐样中丰度显著高于原酒与空白（p＜0.05）。该类物质升高有两种可能性：一是葡萄酒自带挥发物+口腔原有挥发物叠加；二是葡萄酒在口腔代谢新生成。2-甲基-1-丁醇在吐样中含量显著更高。推测来源于酯类水解生成醇，已有文献证实乙酸苄酯可降解生成苯甲醇，另一机理为口腔还原酶将酮、醛等羰基化合物还原为醇，相关醛酮还原酶已被证实存在于唾液。

7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮、丁香醛、苯甲醛含量上升，源于其他单/双酮还原转化。丁香醛、苯甲醛等醛类在吐样中含量显著升高。现有文献仅报道唾液可将醛还原为醇，未发现醛类含量上升现象，本研究为首次证实口腔加工会新生成醛，机理为口腔醇脱氢酶催化醇氧化生成醛。不同酯类变化趋势完全不同，乙酸(3-氧代-2-戊基环戊基)酯在吐样中含量更高，琥珀酸单甲酯、3-羟基苯甲酸乙酯仅在吐样中检出，说明口腔发生酯交换生成全新酯。

值得关注的是，泛解酸内酯、一种未知物（P1429_RT2366_mz108.1）仅在葡萄酒吐样中检出，空白与原酒均无。证明二者由葡萄酒无味前体在口腔内全新合成。已有研究证实口腔微生物酶可水解葡萄酒糖苷类无味前体，释放活性香气。泛解酸内酯由酿酒酵母水解糖苷生成，存在霞多丽、琼瑶浆白葡萄酒与丹魄、美乐红葡萄酒，葡萄酒陈酿阶段没食子糖苷水解也会生成内酯，其香气为甘草、烟熏、烤面包，口腔内新生成会显著改变风味。

四氯乙烷、邻苯二甲酸二甲酯、两种烷烃在吐样中含量升高，推测为环境污染物吸附在口腔黏膜，葡萄酒中乙醇溶解洗脱进入吐样。该结果提示后续实验对照组不能只用清水漱口，应改用乙醇水溶液或模拟酒。

 

3.3.个体生理差异对口腔加工后挥发性轮廓的影响

明确口腔加工对葡萄酒香气的基础改变规律后，本研究进一步探究年龄、性别等人体固有生理变量的作用。O-PLSDA得分图（附图2）显示男女样品无明显分组聚类，说明性别对整体葡萄酒挥发轮廓影响微弱，存在其他干扰变量。

尽管无整体聚类差异，本研究仍对全部特征峰逐一统计，t检验筛选出48种男女间丰度显著差异物质（p＜0.05），其中38种直链/支链烷烃在男性吐样中含量更高。图2箱线图展示6种代表性差异物质：乙酸(3-氧代-2-戊基环戊基)酯、苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚、丁内酯。男性吐样中烷烃、2,4-二叔丁基苯酚（醇类）、苯甲醛（醛类）丰度更高，女性吐样中乙酸(3-氧代-2-戊基)酯、丁内酯含量更高，证明男女唾液酶活力存在区别。

 

 

再按照年龄分组（青年＜35岁，老年＞55岁）开展O-PLSDA。图3得分图可见两组出现明显区分（R²=0.531，p=0.001；Q²=0.266，p＜0.001），证明年龄显著改变葡萄酒经口腔后的挥发组成。但5份青年样品与老年样品重叠，全部来自3名青年女性，说明年龄、性别存在协同交互作用，共同调控口腔香气代谢。

 

 

此外，正交偏最小二乘判别分析（O-PLSDA）筛选出了两类人群挥发性风味组成差异的关键标志物。表2列出了变量重要性投影值大于1（VIP>1）的核心挥发性物质及其初步定性结果。这些物质分属葡萄酒中多种化学类别，包括22种烷烃、14种酯类、9种醇类、7种羧酸、5种酮类、3种内酯、3种酰胺、2种醛类、1种呋喃以及1种含卤化合物。另有10种特征峰的VIP值同样大于1，但在代谢物数据库中未匹配到对应物质，暂归为未知物质，有待后续深入研究（表2）。

值得注意的是，除辛酸乙酯外，其余所有挥发性物质在老年受试者口腔吐出液中的相对含量均高于青年受试者（表2）。该差异源于老年人与青年人在口腔处理葡萄酒过程中，对挥发性物质的口腔行为（包括代谢过程）存在明显区别。其中9种物质（辛酸乙酯、己酸乙酯、3-氧代-2-戊基环戊基乙酸甲酯、琥珀酸单甲酯、二苯甲酮、丙酸、四氯乙烷及支链烷烃）易在口腔内发生代谢转化（详见3.2节与表1）。这一现象说明老年人对葡萄酒挥发性物质的口腔代谢转化程度高于青年人，原因可能是老年受试者唾液酯酶活性更强，或是这类物质在老年人口腔内留存时间更长。酯酶活性升高会加速辛酸乙酯分解，生成辛酸等不同挥发性产物，各类产物香气阈值与香气特征各不相同。老年人吐出液中辛酸乙酯含量更低，也可归因于老年人唾液蛋白含量高于青年人。辛酸乙酯疏水性较强（logP=3.5），易与口腔黏膜薄膜中的蛋白质发生疏水相互作用，因此老年受试者吐出葡萄酒中该物质检出量更低。

青年与老年受试者吐出葡萄酒中挥发性组分的差异，可归因于唾液组分、唾液流速、口腔酶活力以及整体口腔生理指标的人群差异。但不能排除另一可能性，部分差异来源于青年人与老年人唾液挥发性物质组成本身不同，而唾液组分受年龄等多重因素调控。目前，年龄对唾液挥发性组分的影响相关研究仍十分匮乏。

 

 

3.4.年龄与性别共同作用对葡萄酒口腔代谢的影响

本研究先分别探究了年龄、性别单一因素对葡萄酒口腔处理过程中挥发性风味组成的影响，进一步分析二者交互作用，以获得更全面的规律。基于非靶向挥发性物质检测数据开展双因素方差分析，结果显示，同时考虑性别与年龄交互作用时，共有46种挥发性物质存在显著组间差异（p<0.05），性别同样是区分不同受试者葡萄酒口腔吐出液样本的重要因素。

为缩小差异物质范围，本研究采用方差分析-同步组分分析（ASCA），分别识别年龄、性别单一因素及二者交互作用对应的核心变化规律。结合各特征峰杠杆值与平方预测误差（SPE）筛选显著差异变量，其中9种物质平方预测误差小于0.01，说明性别-年龄交互作用可很好地解释这9种物质的含量变化，是造成葡萄酒吐出液风味组分差异的关键标志物。图4箱线图展示了ASCA筛选出的核心挥发性物质在四组受试者（青年、老年、男性、女性）中的含量差异。不同特征物质的含量变化规律各不相同，表明除年龄、性别外，仍存在其他因素共同调控葡萄酒口腔吐出液的挥发性组分。

观察物质变化规律可发现，无论男性还是女性，青年人群内部由性别带来的风味差异均显著大于老年人群（图4）。四组受试者（老年女性、青年女性、老年男性、青年男性）对比结果显示，青年男性组的酮类（乙偶姻）、醇类（2-甲基-1-丁醇）、酯类（2-羟基丙酸乙酯、丁二酸二乙酯）与羧酸（乙酸、异丁酸）相对含量均为四组最低。反观老年受试者群体，老年女性组的2-甲基-1-丁醇、2-羟基丙酸乙酯、丁二酸二乙酯含量更高，老年男性组的烷烃类物质与未知化合物（未知物、未知醇）含量更高（图4）。上述差异挥发性物质此前均未被证实易发生口腔代谢，该发现完善了年龄-性别交互作用如何调控葡萄酒经口腔处理后风味组成的相关理论。

 

 

结论

 

本研究证实，口腔模拟吞吐实验（SOOM）结合气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）非靶向挥发性物质检测技术，可有效表征口腔处理对葡萄酒挥发性风味组成的影响。现有葡萄酒口腔代谢相关研究仅检测20~30种靶向香气物质，而本方法可检出248种挥发性特征峰。葡萄酒中挥发性物质分为内源代谢产物与外源杂质（食物、护肤品残留）两类，本研究证实口腔代谢会生成多种醇类与羧酸，唾液酯酶、过氧化物酶等酶系是该转化过程的关键媒介。在探究人体自身生理指标对葡萄酒口腔风味演变的影响时，证实年龄、性别均会改变葡萄酒经口腔作用后的香气组成。二者交互效应表明，性别造成的风味差异在青年群体中远高于老年群体。本研究同时筛选出受年龄、性别调控的关键差异挥发性标志物。

本研究数据完善了葡萄酒香气物质在口腔内转化演变的相关认知，明确了葡萄酒口腔吐出液挥发性组分的显著变化，填补了口腔处理过程影响葡萄酒挥发性物质组成的相关研究空白。同时，本研究指出若干待深入探索的方向，后续可进一步验证该风味变化对葡萄酒感官品质的实际影响。

 

 

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