J. Agric. Food Chem：温度和乙醇对模型酒体系中原花青素吸附动力学的影响

温度和乙醇对模型酒体系中原花青素吸附动力学的影响

期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry（6.7）

发表日期：2020年

引言

近年来，原花青素在植物细胞壁上的吸附已成为食品和饮料生产者的关注热点，这既是因为原花青素作为抗氧化剂的健康益处，也源于生产者希望更高效、更稳定地利用原料。红葡萄酒生产者尤其需要了解原花青素在葡萄细胞壁上的吸附行为，因为在浸渍过程中葡萄皮、籽和果肉均存在，这些组织含有大量细胞壁材料（CWM）。了解发酵过程中原花青素与葡萄皮、籽和果肉细胞壁的相互作用，可使酿酒师更有效地控制成品红葡萄酒的化学成分和感官特征。

已有多项研究探索了多酚类物质提取的经验模型,但尚无模型被广泛应用为商业化酿酒的预测性定量模型。这种不准确性可能源于浸渍和发酵过程中发生的复杂竞争反应，这些反应降低了成品中多酚的浓度。多酚在皮帽细胞壁上的吸附很可能是上述模型未能考虑的因素之一。也有研究在一定程度上考察了模型酒体系中葡萄源 PA 在葡萄源 CWM 上的吸附。有研究这些反应中的键合类型进行了分类，提出氢键和疏水作用是主要贡献者，范德华力也可能参与其中。也有研究探索了不同 PA 溶液与葡萄 CWM 接触后的组分变化，发现 CWM 优先吸附较大的 PA 而非较小的 PA。然而，部分 PA 吸附相关研究似乎得出了相互矛盾的结论。

此外，关于该液-固吸附体系的一些关键信息尚未见报道。具体而言，葡萄源 PA 在葡萄源 CWM 上的吸附动力学和完整定量损失均未被描述。反应速率在这类体系中至关重要，因为这些反应主要由弱作用力驱动，体系可能需要相当长的时间才能达到平衡。另外，PA 吸附的定量通常采用间苯三酚解离法以产率百分比计算。虽然该技术足以分析 PA 的组成，但由于其无法分离某些 PA 链，作为定量方法并不完整。同时，许多关于葡萄 PA 在 CWM 上吸附的研究仅在单一温度和固定乙醇浓度下进行。这种相关性的一部分可能源于温度和乙醇对多酚-CWM 吸附反应的影响。了解这些因素如何影响 PA 在 CWM 上的吸附，是建立红葡萄酒生产预测模型的必要组成部分。

本研究旨在填补当前 PA 吸附研究中的若干空白。通过构建不同温度和乙醇浓度下葡萄源 PA 在葡萄皮源 CWM 上吸附的进程曲线，估算了反应速率。量化了各条件下的 PA 吸附量，并利用这些数据建立了模型酒体系的吸附等温线和预测模型。此外，还分析了 PA 溶液的组成，以确定是否存在对特定 PA 的优先吸附。

 

材料与方法

 

2.1试剂、2.2仪器与软件、2.3统计分析、2.4葡萄皮细胞壁材料的分离、2.5原花青素的分离

详见原文。

 

2.6体外吸附实验

使用 10 mg（±0.5 mg）CWM，以代表单颗葡萄果实中果皮 CWM 的常见质量。将果皮源和种子源 PA 材料分别溶于模型酒中，然后按 1：1 比例混合。PA 浓度选择 500 mg/L、1，000 mg/L 和 1，500 mg/L，因为葡萄中原花青素的浓度通常在 0.5–1.5 g/L 范围内。此外，每个条件下均设置含模型酒但不含 PA 材料的三次重复空白样品，以验证 CWM 对任何测量均无可检测影响。模型酒的乙醇浓度视具体实验参数而定（表 1）。将水合后的 CWM 和 PA 溶液分别放入培养箱/摇床中 1 小时以达到实验温度。随后将 PA 溶液与 CWM 接触，在混合后 1、5、60、180、360、480 和 720 分钟时间点从上清液中取 100 μL 样品。通过对比对照溶液分析这些样品，以确定 PA 吸附的定量效应。初始采样持续 24 小时，但在所有测试条件下 12 小时后浓度均无显著变化，因此调整了实验方案。样品在 -80°C 保存，并在采样后 24 小时内完成分析以避免降解。所有实验条件均进行三次重复，并设置三次重复对照样品（含相同 PA 溶液但不含 CWM）。720 分钟后，从所有试验样品和对照样品上清液中取 1.5 mL，冻干后于 -80°C 保存。这些样品用于分析吸附对 PA 溶液组成的定性影响。所有样品在储存后 30 天内完成分析以避免降解。

 

 

2.7原花青素混合物的定量分析、2.8Langmuir 模型、2.9原花青素混合物的定性分析

详见原文。

 

研究结果

 

3.1进程曲线

进程曲线通过 720 分钟内对上清液的连续采样绘制，显示溶液中 PA 浓度的变化。图 1 展示了各独特条件下 PA 吸附的进程曲线。所有试验中 PA 溶液浓度均有所下降，但各条件达到平衡所需的吸附程度和时间各不相同。

 

图 1：PA 溶液与细胞壁材料接触后浓度的进程曲线

 

在 0% EtOH-15°C 实验中，起始浓度为 500 mg/L 和 1，000 mg/L 的 PA 溶液在 480 分钟时达到平衡（即 PA 浓度不再显著变化），但 1，500 mg/L 试验在 720 分钟取样时浓度仍在下降（图 1）。这表明该体系中的吸附反应具有浓度依赖性。该假设与典型的 Langmuir 模型体系一致，因为随着体系中吸附质分子增多，吸附剂表面可用位点的竞争加剧。在 0% EtOH-30°C 实验中，所有三个试验均在 180 分钟时达到平衡，表明 PA 与 CWM 之间的反应速率具有温度依赖性。15% EtOH-15°C 实验显示所有条件在 360 分钟时达到平衡，表明乙醇浓度不仅影响 PA 在 CWM 上的定量吸附，也是 PA 吸附反应速率的决定因素之一。这可能源于 PA 溶解度的提高——这是 PA 在 CWM 上吸附的竞争反应。最后，15% EtOH-30°C 实验中所有条件在 180 分钟时达到平衡，这与 PA 吸附反应速率与温度和乙醇浓度正相关的假设一致。

 

3.2相对原花青素吸附量

图 2 显示了各条件下每毫克 CWM 吸附的最终 PA 量（以 C.U.计）。显然，吸附量与温度和乙醇均呈负相关。在含 15% 乙醇的两个条件下吸附量急剧下降，表明在酿酒条件下，葡萄酒的最终乙醇浓度可能比发酵温度对溶液中 PA 的保留更为重要。除含 15% 乙醇的条件外，其余条件下三个 PA 浓度之间的吸附量均有显著差异；在高乙醇条件下，1，000 mg/L 和 1，500 mg/L 试验的吸附量无显著差异。在同一起始 PA 浓度下，随着温度和乙醇升高，各条件吸附量总体呈下降趋势，但并非所有条件间差异均显著。起始 PA 浓度为 500 mg/L 时，0% EtOH-30°C 与 7.5% EtOH-22.5°C 之间的吸附量无显著差异。起始浓度为 1，000 mg/L 时，0% EtOH-15°C 与 0% EtOH-30°C 之间无显著差异。此外，15% EtOH-15°C 与 15% EtOH-30°C 之间在任何起始 PA 浓度下均无显著差异。

 

图 2：单位质量 CWM 吸附的 PA 质量

 

在 0% EtOH-15°C 条件下与溶液接触 12 小时后，起始浓度 500 mg/L、1，000 mg/L 和 1，500 mg/L 溶液中 PA 的总平均损失分别为 58.5%、48.0% 和 42.1%。0% EtOH-30°C 条件下的平均损失分别为 49.6%（500 mg/L）、44.8%（1，000 mg/L）和 38.6%（1，500 mg/L）。在葡萄酒生产背景下，这两个条件的比较对冷浸后发酵前（即无乙醇产生）温度驱动的吸附 PA 回收具有启示意义。在 7.5% EtOH-22.5°C 条件下，PA 因吸附的平均损失分别为 52.6%（500 mg/L）、41.0%（1，000 mg/L）和 33.3%（1，500 mg/L）。在 15%-15°C 条件下，平均损失分别为 45.4%（500 mg/L）、32.9%（1，000 mg/L）和 22.9%（1，500 mg/L）。最后，15%-30°C 条件下的平均损失分别为 38.0%（500 mg/L）、27.6%（1，000 mg/L）和 20.8%（1，500 mg/L）。但如图 2 所示，并非所有这些计算值之间均存在显著差异。总体来看，PA 因吸附损失的百分比随温度和乙醇浓度的升高而相对下降，表明温度和乙醇浓度对 PA-CWM 相互作用的阻碍具有动态影响。此外，这些结果表明，在红葡萄酒发酵的高温高乙醇条件下，葡萄果实中高达 38% 的 PA 可能因与皮帽中固体的吸附作用而无法被提取。

 

3.3吸附等温线与 Langmuir 模型

图 3 显示了所有条件下的吸附等温线以及应用于各条件的 Langmuir 模型曲线。模型通过对实验数据的回归分析构建，以拟合 Langmuir 方程（方程 1）的最佳曲线。通过该技术计算得到的平衡常数和饱和吸附量理论值见表 2。

 

图 3：所有条件的吸附等温线及应用的 Langmuir 模型

 

 

比较各条件计算所得平衡常数和饱和吸附量值，随着温度和乙醇升高，平衡常数总体增大，饱和吸附量总体减小。这在逻辑上是合理的，因为 PA 的溶解度（与吸附竞争的相互作用）在较高温度和较高乙醇基质中均增强。平衡常数值的升高并非是由于PA-CWM 络合物浓度的增加，而是很可能反映了随着体系中温度和乙醇升高，吸附剂上可用结合位点总量（位于平衡常数的分母中）的减少。该趋势的例外是 0% EtOH-30°C 的平衡常数相比 0% EtOH-15°C 略有下降，这可能是由于使用回归分析计算数值时在饱和吸附量常数中对此值进行了数学补偿。此外，用于构建这两个等温线的数据非常相似，因此数值也非常接近。饱和吸附量的总体减小反映了吸附剂饱和点的降低，这是可用开放结合位点减少以及较高温度和乙醇浓度下更多 PA 分子倾向于留在溶液中而非形成 CWM 络合物的共同结果。这也是预期之中的，因为 PA-CWM 络合物相对于溶液中游离 PA 的比较稳定性在较高温度和乙醇浓度下会降低。同样，例外情况出现在 0% EtOH-30°C 与 0% EtOH-15°C 的比较中，这同样可能只是由于相似的数据和用于计算理论常数的数学方法所致。

考虑到 PA 在红葡萄酒基质中的性质，自缔合作用在模型实验中需要予以考虑。尽管已有研究指出 PA 能够在一定程度上发生自缔合，但本数据表明在所研究条件下自缔合对 PA 吸附的影响可能不显著。如果自缔合 PA 以显著量吸附到 CWM 上，Langmuir 等温线的主要假设之一将被违反，则需要考虑“多层”吸附模型（如 B.E.T. 等温线）。然而，在本研究所测试的浓度和基质范围内，并未观察到在高浓度吸附质下吸附量呈指数增长——即多层吸附体系的典型特征。这可能是因为不同尺寸和亚基的 PA 分布产生了空间位阻，阻碍了分子间的 π-π 共享，或者需要进一步提高 PA 溶液浓度才能使该现象在所测试基质中被观察到。在红葡萄酒生产背景下，应用提高PA 浓度范围的吸附模型意义有限。基于这些原因，选择 Langmuir 模型对收集的数据进行拟合。

 

3.4间苯三酚解离法分析溶液中 PA 的组成

在 720 分钟后对各条件试验组和对照组的冻干上清液进行间苯三酚解离分析。比较对照组与试验组之间的平均分子量、mDP、没食子酰化率（儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯亚基）和没食子单元比例（没食子儿茶素和表没食子儿茶素亚基），以确定各条件下 CWM 是否优先吸附不同尺寸或组成的 PA。数据显示，在某些条件下对照组与试验组之间的没食子酰化率存在显著差异（表 3 中以 * 标记），但随温度或乙醇的变化未呈现可辨别的趋势。此外，对照组与试验样品之间没食子酰化率的最大差异为 5.24%（500 mg/L-15% EtOH-15°C），如此小的差异在红葡萄酒生产背景下可能不会产生可辨别的影响。四个条件下对照组与试验样品之间的没食子单元比例存在显著差异，但差异均小于 2%，且随温度或乙醇浓度变化未呈现可辨别的趋势（数据未显示）。根据这些结果，在本实验条件下，CWM 似乎并不优先吸附皮肤源 PA 而非种子源 PA，反之亦然。平均分子量（aMW）和 mDP 在间苯三酚解离法中直接相关。在大多数试验中，试验样品的 aMW 和 mDP 低于对照组，但少数条件下无显著变化。需要注意的是，间苯三酚解离法利用游离黄烷-3-醇单体与间苯三酚加合物单体的比例来计算，因此只能用于确定 PA 的平均分子量和聚合度。此外，该方法无法裂解 A 型 PA。基于这些原因，采用 GPC 进一步确定试验组与对照组之间 PA 尺寸的变化。

 

 

3.5凝胶渗透色谱

摩尔质量在 PA 样品累积质量分布的 90% 处计算。按照惯例采用此指标而非 50% 累积分布，因为 PA 混合物的质量分布不遵循正态高斯分布。上清液的 GPC 分析显示，所有试验样品的摩尔质量相比各自对照组均有所下降（图 4）。这一结果表明，较高摩尔质量的 PA 通过吸附被选择性地从溶液中去除。

 

图 4：吸附实验对照组和试验样品在 90% 累积质量处的摩尔质量分布

 

图 5通过各条件下对照组平均摩尔质量与试验组平均摩尔质量的差值计算了各条件下试验样品相比对照组的摩尔质量降低百分比。与其他四个条件相比，0% EtOH-15°C 条件的摩尔质量下降幅度显著更大。这可能表明在较低温度和乙醇浓度下，较大的 PA 与 CWM 的相互作用在热力学上比与模型酒组分的相互作用更为稳定。尽管已有文献指出 PA 的溶解度与温度和乙醇浓度正相关，但目前尚无关于特定尺寸 PA 溶解度随乙醇浓度变化的报道。需要进一步研究以阐明该观察结果的机理。

 

图 5：因吸附导致的 PA 溶液摩尔质量降低百分比

 

3.6温度和乙醇对原花青素-细胞壁材料相互作用的影响

升高的温度和乙醇浓度对葡萄 PA 在葡萄皮 CWM 上的吸附程度具有明显的负相关影响。在本研究的独立条件下，数据趋势似乎符合 Langmuir 模型，且在一定置信度内可预测。温度和乙醇对吸附反应的平衡常数和 CWM 的吸附容量具有协同效应。对 PA 在 CWM 存在下浓度的连续监测表明，PA-CWM 相互作用的反应速率同时受温度和乙醇浓度驱动。在低温和低乙醇浓度条件下，PA 吸附发生的时间远长于以往报道。这强调了研究这些固-液吸附体系动力学的重要性，以建立标准化的采样方案，特别是在比较类似的 PA 吸附研究时。

温度和乙醇浓度对特定 PA 吸附的影响较为复杂。在本研究制备的体系中，葡萄源 CWM 优先吸附模型体系中分子量较大的 PA，且温度和乙醇最终影响了被结合的 PA 的尺寸。此外，未观察到 PA 亚基组成的优先吸附呈现可辨别的趋势。这可能意味着 PA 亚基组成在所研究体系中不主动参与优先吸附，或者体系中竞争因素过多，难以显现出可识别的模式。无论哪种情况，都需要更简单的、混杂变量更少的体系来阐明化学机理。

 

研究结论

 

在红葡萄酒生产背景下，本研究结果表明 PA 因吸附于 CWM 而造成的损失在温度和乙醇浓度方面可能是可预测的。本研究实验获得的数据最终被用于开发红葡萄酒生产中关键酚类物质提取的工业化应用机理模型。本研究中的方程 2 和方程 3 被纳入该提取模型，即使在超出本模型研究温度范围外推时，仍与酿酒数据表现出良好的拟合性。构建完整的红葡萄酒发酵计算模型还需要研究一些尚未解决的混杂因素，包括 PA 与葡萄酒基质中其他化学成分的相互作用及其对 PA 吸附的影响。未来的研究将致力于阐明其他葡萄源多酚对 PA-CWM 吸附相互作用的影响。