Food Chem：葡萄酒基质组成对口腔香气释放的影响

葡萄酒基质组成对口腔香气释放的影响

期刊：Food Chemistry（10.4）

发表日期：2018年3月

 

 

研究摘要

 

本研究旨在探究模拟饮用葡萄酒的场景下，葡萄酒基质组分是否会影响香气物质与口腔黏膜的相互作用。实验选取12款不同葡萄酒，预先添加6种目标香气物质，让3名受试者含漱葡萄酒后，采用活体口腔固相微萃取（in vivo intra-oral SPME）技术追踪口腔内释放的香气物质。结果表明，葡萄酒基质组分对部分香气物质的口腔释放量存在显著影响，其中酚类物质的作用最为突出，且该效应由酚类的化学结构决定。部分酚酸（马尿酸、咖啡酸等）会提升芳樟醇、β-紫罗兰酮等香气在口腔中的释放量，而黄酮类物质则会抑制己酸乙酯等脂肪酯的口腔释放。本研究首次在人体生理真实口腔环境下，证实葡萄酒组分能够调控香气与口腔黏膜的相互作用。

 

研究背景

 

香气感知分为两个阶段：首先是鼻前嗅觉，直接闻香形成初始香气印象，其次是饮用吞咽过程中的鼻后嗅觉，该阶段是葡萄酒香气感知的延续。只有软腭与舌缘通道打开、吞咽气流携带香气分子进入鼻腔时，鼻后嗅觉才会产生。鼻后嗅觉分为两类：刚咽下葡萄酒时的瞬时香气感受，以及吞咽后持续留存的余香，后者决定葡萄酒的香气持久度。

产生留香的核心机制是香气分子吸附在口腔、咽喉黏膜，形成香气储存层或薄膜。香气分子与口腔黏膜的结合能力，不仅取决于自身理化性质，还受葡萄酒基质组成、人体生理条件（唾液组分等）共同调控。因此，香气持久度由两大因素共同决定：香气分子与口腔黏膜的吸附能力、储存层中香气分子的释放速率。

已有研究模拟葡萄酒饮用场景，探究香气分子结构与理化性质对其口腔吸附能力的影响。采用活体口腔固相微萃取（in vivo intra-oral SPME）方法监测吐酒后5分钟内的香气释放动力学发现酯类香气在含漱后的数秒内快速释放，但浓度迅速衰减，留香弱，而β-紫罗兰酮、愈创木酚等物质释放平缓、持续时间更长，口腔留香更持久。上述释放规律虽与香气分子自身理化性质高度相关，但葡萄酒中非挥发性基质组分同样会改变香气与口腔黏膜的结合能力。酚类与口腔组织发生结合后，会和香气分子产生竞争吸附，改变香气与黏膜的相互作用速率。

此外，大量体外实验证实香气分子与葡萄酒基质组分间存在相互作用。由此可推断，该类相互作用在人体口腔环境中同样存在，会改变香气在黏膜上的吸附、释放速率，最终影响葡萄酒留香。但目前关于特定葡萄酒基质组分如何调控香气-黏膜相互作用、改变香气释放的机理研究十分匮乏，现有相关成果仅停留在感官品评层面。这类研究通过向葡萄酒中添加不同非挥发性物质设计对照样品，结合时间-强度感官实验，证明葡萄酒基质差异与香气持久度存在相关性。

 

材料与方法

 

2.1.葡萄酒样品

12款西班牙商业酒，这些葡萄酒涵盖了不同的酿酒工艺：4种白葡萄酒、2种桃红葡萄酒和6种红葡萄酒（表1）。为了尽量减少乙醇对香气化合物挥发性的影响，所有葡萄酒统一调配至14.5% vol。统一添加6种标准香气（表2），终浓度1 mg/L，消除酒本身内源香气差异，方便对比基质单一变量。

 

 

2.2.Intra-oral SPME采样

1. 受试者：3名经过标准化口腔SPME培训健康女性，实验前2 h禁食禁饮禁烟，实验前碳酸氢钠溶液漱口统一口腔基底状态。

2. 操作流程：15 mL葡萄酒含漱30s（紧闭嘴唇、软腭闭合不吞咽）吐出；吐酒后30 s将DVB/CAR/PDMS萃取纤维放入口腔萃取2 min，萃取香气直接进GC-MS检测。每款酒3人×3次重复，共108组检测。

3. GC-MS检测。

 

2.3.化学组分测定

 

2.4.统计分析

 

研究结果

 

3.1.葡萄酒化学组分

本研究首先测定了全部实验葡萄酒的化学指标，包括总多酚、中性多糖、游离氨基酸、游离氨基酸+多肽总量以及pH值，测定结果如表1所示。

如预期结果，红葡萄酒总多酚（TP）含量更高，样品WRd-1总多酚为2104 mg/L，WRd-4为1347 mg/L。白葡萄酒总多酚整体偏低，不同品种间波动较小。弗德乔白葡萄酒（WWh-3）为286 mg/L，马卡贝奥白葡萄酒（WWh-1）达到最低值152.5 mg/L。桃红葡萄酒总多酚含量与白葡萄酒接近，但丹魄桃红（WRs-1）多酚含量几乎是加尔纳恰桃红（WRs-2）的两倍。中性多糖（NP）方面，马尔瓦白葡萄酒（WWh-2）含量最高，原因是该酒未完成酒精发酵，残糖较高。除这款酒以外，中性多糖含量最高为2012年份丹魄红葡萄酒（WRd-2），最低为马卡贝奥白葡萄酒（WWh-1），整体来看不同酒款的中性多糖无明显分群差异。游离氨基酸含量在各葡萄酒间差异显著。单品霞多丽白葡萄酒（WWh-4）达到全部样品最高值739 mg/L，马尔瓦白葡萄酒（WWh-2）含量最低，仅128.14 mg/L。这种巨大差异大概率受葡萄栽培（品种、气候）与酿造工艺（发酵条件、酵母菌株）多重因素共同影响。游离氨基酸+多肽总量的变化趋势与游离氨基酸完全一致。pH值方面，马尔瓦（WWh-2）、马卡贝奥（WWh-1）两款白葡萄酒最低为3.05，同一酒庄酿造的三款丹魄红葡萄酒（WRd-1、WRd-2、WRd-3）pH最高，达3.8。采用方差分析（ANOVA）验证红、桃红、白三类葡萄酒的组分差异，结果见表1。总多酚、pH是两类存在显著组间差异的指标（p＜0.05），红葡萄酒的两项数值均显著高于白葡萄酒与桃红葡萄酒。

 

3.2.葡萄酒含漱后口腔黏膜释放香气

三名受试者分别用12款葡萄酒含漱，持续2分钟监测口腔释放香气，所有数据均按照2.1节方法扣除人体内源香气本底值。同一款葡萄酒对应的口腔香气释放量个体差异较大（表S2）。数据离散主要源于受试者口腔生理差异，包括唾液流速、唾液组分、口腔容积等。

为消除个体差异干扰，取三名受试者均值开展单因素方差分析，验证葡萄酒基质是否会影响口腔香气释放。结果显示，乙酸异戊酯、己酸乙酯、β-苯乙醇的口腔释放量受酒款类型显著影响（p＜0.05）。如图1所示，饮用WWh-1白葡萄酒、WRs-2桃红葡萄酒后，乙酸异戊酯的口腔释放量更高，WRs-2桃红同时拥有极高的己酸乙酯、β-苯乙醇释放水平。白、桃红葡萄酒的乙酸异戊酯释放差异更明显，各红葡萄酒之间该指标表现趋同。相比白、桃红，红葡萄酒含漱后乙酸异戊酯释放量偏低。另一类酯类物质己酸乙酯呈现完全相同规律，红葡萄酒组的口腔释放量显著更低，例如WRd-4红葡萄酒的己酸释放量仅为WWh-2白葡萄酒的十二分之一。β-苯乙醇则呈现相反趋势，所有红葡萄酒含漱后，该物质口腔释放量均高于白、桃红，仅WRs-2桃红表现与红葡萄酒相近。剩余三种目标香气（芳樟醇、愈创木酚、β-紫罗兰酮）在三类葡萄酒间无显著释放差异，推测原因是该三类物质人体个体释放波动过大，且整体检出浓度偏低，掩盖了酒款带来的基质差异。

 

 

为挖掘口腔香气释放与葡萄酒基质组分的内在关联，将口腔香气数据与葡萄酒化学指标合并开展主成分分析（PCA），结果见图2。模型提取两个主成分，共解释近56%的数据变异。第一主成分（PC1）可实现红葡萄酒与白、桃红的区分，红葡萄酒在PC1上为正值，白、桃红为负值。该主成分与β-紫罗兰酮（-0.72）、己酸乙酯（-0.67）、乙酸异戊酯（0.60）、pH（0.88）、总多酚（0.68）、总氨基酸（0.65）高度关联。所有白、桃红葡萄酒在PC1上均为负值，但霞多丽白葡萄酒WWh-4偏离该规律，在PCA图中更靠近红葡萄酒分组。对照其组分（表1）可知，这款白葡萄酒中性多糖、含氮物质（氨基酸、多肽）含量极高，pH也更接近红葡萄酒。第二主成分（PC2）与芳樟醇（0.88）、愈创木酚（0.77）、β-紫罗兰酮（0.56）、β-苯乙醇（0.53）呈强正相关，但与葡萄酒各项化学组分相关性均较弱。PC2的作用是区分同一大类下不同酒款，例如WRd-1、WRd-5两款红葡萄酒的四类香气口腔释放量，显著高于其余红葡萄酒。

本实验全部葡萄酒pH区间在3.05~3.8，补充表S3结果证实该小幅pH波动对口腔香气释放几乎无明显作用。排除pH影响后，数据证实葡萄酒基质组分（核心为总多酚）会调控部分香气的口腔释放行为。多酚含量更高的红葡萄酒，酯类（己酸乙酯、乙酸异戊酯）口腔释放量更低，β-苯乙醇释放量更高。但即便同为红葡萄酒，各酒款间香气释放仍存在巨大差距，因此下文进一步分析各类基质组分的单独作用。

 

 

3.3.葡萄酒酚类物质组分特征分析

上述结果表明，葡萄酒对香气与口腔黏膜相互作用的影响，不仅取决于总多酚含量，更由酚类物质的具体组分决定，进而至少会改变部分香气物质在口腔中的释放量。为验证该推论，本研究采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）对12款葡萄酒的酚类指纹图谱进行完整表征，检测结果见表S4。实验共定量检出58种酚类物质，分属花青素、简单酚、苯甲酸、扁桃酸、黄烷-3-醇、苯丙酸、肉桂酸、白藜芦醇类、黄酮醇九大类别。与预期一致，红葡萄酒的花青素总量与非花青素酚总量均高于白葡萄酒、桃红葡萄酒。红葡萄酒间花青素含量差异悬殊，WRd-2的花青素含量（464±28 μg/L）约为含量最低的WRd-1（111±13 μg/L）的四倍，但六款红葡萄酒的非花青素酚含量整体相近。白葡萄酒的花青素、非花青素酚含量无明显样品间差异，桃红葡萄酒则区分显著，WRs-2的花青素与非花青素酚两类物质含量均远高于WRs-1。

为明确哪类多酚是造成葡萄酒组分差异的核心因素，以12款葡萄酒、58种酚类物质浓度为变量开展PCA分析，补充图1为分析结果可视化图谱，前两个主成分共解释约73%的数据变异。PC1可将红葡萄酒（PC1得分正值）与桃红、白葡萄酒（PC1得分负值）完全分开，该主成分与多种多酚呈强正相关。各类花青素（锦葵素葡萄糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、矢车菊素-6-3-香豆酰葡萄糖苷）相关系数＞0.93，黄烷-3-醇（儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、B2、原花青素C1二聚体）相关系数＞0.97，说明红葡萄酒中上述物质浓度显著更高。PC2可解释近23%数据变异，能将WRd-1、WRd-2、WRd-3（PC2正值）与其余三款红葡萄酒WRd-4、WRd-5、WRd-6（PC2高负值）区分开。PC2与多种简单酚、肉桂酸类酚呈正相关（焦性没食子酸、邻苯二酚、4-乙基邻苯二酚、马尿酸相关系数0.7~0.8；咖啡酸0.7、香豆酸0.8），与黄酮醇（山奈酚、异槲皮素，-0.7）、酒石酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、白皮杉醇呈负相关（-0.8）。值得注意的是，PC2得分为正的WRd-1、WRd-2、WRd-3产自同一酒庄，仅采收年份不同。相较于其他红葡萄酒，三款酒邻苯二酚、肉桂酸含量更高，黄酮醇含量更低。

 

3.4.葡萄酒酚类组分与口腔香气释放的相关性分析

为明确各类酚物质在口腔饮用过程中对香气释放的影响，将口腔香气释放量与各酚含量进行皮尔逊相关性分析，酚变量筛选依据主成分PC1、PC2中区分度最高的特征物质，结果见表3。

 

 

愈创木酚的口腔释放量与各类酚均无显著相关，β-苯乙醇、芳樟醇、β-紫罗兰酮则与马尿酸、咖啡酸、对香豆酸、4-羟基苯乙酸等小分子酚酸呈强正相关（r＞0.7）。图3直观展示不同酒样中咖啡酸含量与β-紫罗兰酮口腔释放量的正相关关系。与之相反，两类酯类香气的口腔释放量与多数酚类物质呈负相关，其中己酸乙酯相关性具备统计学显著性。己酸乙酯释放量与花青素、黄烷-3-醇两类黄酮物质显著负相关（表3）。花青素、黄烷-3-醇均为C6-C3-C6三环黄酮结构，与C6-C1、C6-C3型小分子酚酸化学结构差异显著。其中锦葵素-3-葡萄糖苷（r=-0.88）、矢车菊素-3-葡萄糖苷（r=-0.67）、矢车菊素-3-(6-对香豆酰)葡萄糖苷（r=-0.67）对己酸乙酯释放抑制作用最强；黄烷-3-醇是第二大类抑制物质，儿茶素（r=-0.65）、表儿茶素（r=-0.66）、原花青素B1（r=-0.69）、原花青素B2（r=-0.72）、原花青素C1三聚体（r=-0.76）均呈现较强负相关，且聚合原花青素的抑制作用强于单体儿茶素、表儿茶素。图3同步展示该负相关规律，原花青素B2含量越低的酒样，口腔中己酸乙酯释放量越高。现有模型体系、静态顶空体外实验表明，儿茶素、表儿茶素等单体黄酮可通过弱疏水作用、π-π堆叠结合香气分子，降低其挥发性。

 

 

但上述结论大多基于体外体系，并未模拟人体口腔生理环境，忽略唾液的参与。学界已知唾液蛋白可与黄烷-3-醇、花青素等黄酮多酚结合，这也是葡萄酒涩感产生的核心机制。但多酚-唾液蛋白相互作用如何改变香气释放，相关研究极少且多停留在体外模拟。

无论具体作用机制，本研究结果说明高黄酮（黄烷-3-醇、花青素）葡萄酒中己酸乙酯口腔释放量更低，不能仅用香气疏水性解释。β-紫罗兰酮、芳樟醇疏水性更强，却无同类抑制效应，乙酸异戊酯与己酸乙酯同属酯类，脂水分配系数logP=2.26相近，释放规律也不一致。一种合理解释为除疏水性外，分子化学结构是体内环境下多酚-香气相互作用的关键变量。例如β-紫罗兰酮、芳樟醇含芳香环，乙酸异戊酯碳链带有支链，空间位阻会削弱其与多酚、多酚-蛋白复合物的疏水结合能力。静态顶空分析需要平衡时间，体系内各类疏水香气均可充分与多酚发生相互作用，但人体活体口腔动态环境下该结合作用大幅减弱。即便如此，口腔内多酚与香气的相互作用仍具备感官研究价值，已有感官实验证实单宁含量会显著改变3-异丁基-2-甲氧基吡嗪带来的青椒风味持久度。

 

研究结论

 

本研究首次采用活体口腔检测技术，模拟真实饮用场景，证实葡萄酒基质组分可调控口腔香气释放。在各类葡萄酒化学指标中，酚类物质对口腔香气总释放量影响最为显著，且作用效果由酚、香气两类物质的化学结构共同决定。小分子酚酸会提升β-苯乙醇、芳樟醇、β-紫罗兰酮等多种香气的口腔释放量，黄烷-3-醇、花青素类黄酮则会抑制己酸乙酯等酯类香气释放。该差异源于多酚与唾液蛋白的结合行为，复合物会优先络合直链长链脂肪酯这类疏水性香气分子。

后续仍需以模拟合成酒为简化模型、扩大受试者样本量开展活体与感官联合实验，降低个体差异，验证本推论并评估该机制的感官实际意义。但整体而言，本研究在贴近人体真实生理的口腔环境下，解析了葡萄酒组分与口腔黏膜香气交换的内在规律，提供了活体分析实验数据，完善了葡萄酒香气感知、尤其是香气留香的复杂作用机理。