Food Chem：人工唾液沉淀指数（ASPI）：一种葡萄酒涩感的高效评价方法

人工唾液沉淀指数（ASPI）：一种葡萄酒涩感的高效评价方法

期刊：Food Chemistry（10.4）

发表日期：2023年7月

 

 

研究摘要

 

涩感是红葡萄酒最重要的感官特征之一，其强度评价方法是近年来的研究热点。本研究基于唾液沉淀指数（SPI），构建人工唾液体系，建立准确、可靠的干红葡萄酒涩感强度评价方法。为此，从人全唾液中筛选出5种在蛋白质单宁结合反应中具有高反应活性与高灵敏度的关键蛋白组分。以人体唾液生理条件为基准，采用响应面法对5种蛋白（富含脯氨酸蛋白、α‑淀粉酶、乳铁蛋白、溶菌酶、白蛋白）的浓度及pH进行优化，以此模拟真实唾液环境。将人工唾液沉淀指数法应用于60款市售干红葡萄酒，该方法与感官评分呈现高度相关性（CoefASPI = 0.94），表现优于传统SPI方法及其他分析手段。

 

研究背景

 

涩感是干红葡萄酒最重要的感官特征之一，在葡萄酒品质评价中起到不可或缺的作用。单宁蛋白质结合沉淀理论已得到广泛认可：首先，单宁与蛋白质发生络合反应生成可溶性聚集体；随后，在协同弱分子间桥接作用驱动下，络合分子相互靠近并发生聚集，分子尺寸增大，转变为不溶性沉淀物；最终，沉淀物通过分子间交联自发聚集，形成口腔可感知的大分子复合物。干红葡萄酒的涩感普遍认为来源于酚类组分与唾液蛋白的相互作用，该作用会在口腔内产生干涩、收敛的感官感受。

在以往葡萄酒涩感评价研究中，明胶指数、甲基纤维素单宁沉淀法（MCP）等单宁沉淀检测方法应用较为普遍，福林‑肖卡法、福林‑丹尼斯法结合感官评分的评价手段也有使用。但上述方法对葡萄酒中各类酚类组分无选择性响应，会高估花青素、酚酸等涩感贡献较弱组分的涩感强度，因此并不适用于涩感强度表征。牛血清白蛋白（BSA）单宁沉淀法可规避三氯化铁显色步骤中花青素的干扰，被广泛用于涩感评价。但部分研究表明该方法对黄烷醇单体结合亲和力不足。此外，基于人体唾液的唾液沉淀指数（SPI）可用于预测葡萄酒单宁涩感，已有研究证实其与真实味觉结果相关性良好，但也有部分研究报道该方法的相关系数并不理想。

红葡萄酒中的缩合单宁属于原花青素含量丰富的复杂组分，普遍认为是干红葡萄酒涩感产生的核心物质。相较于桶陈、发酵过程添加商用橡木制品引入的水解单宁，缩合单宁对唾液蛋白具备更强的亲和力与结合能力。花青素等其余酚类组分带来的涩感贡献弱于黄烷—3—醇。花青素与单宁缩合生成的衍生物分子内化学键增多，可与唾液蛋白结合的位点减少，进而降低涩感强度。综合考虑口腔内缩合单宁与唾液蛋白真实结合过程，以及各类单宁沉淀检测方法的优缺点，本研究旨在构建人工唾液体系，实现葡萄酒涩感精准、稳定的评价。本研究以期建立一套操作简便、稳定性好、通用性强的涩感强度检测方法，可用于实际生产中葡萄酒品质评估。

 

材料与方法

 

2.1.试剂与原料

实验试剂均为色谱纯/分析纯，人工唾液蛋白采用商品化试剂：聚-L-脯氨酸替代天然富含脯氨酸蛋白（PRPs）、α-淀粉酶、溶菌酶、牛血清白蛋白、乳铁蛋白。

以不同浓度（0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 g/L）的商用缩合单宁（CT）配置模拟酒液（5 g/L酒石酸，0.2 M NaCl，12 % v/v，pH 3.6）。

试验酒样共65款市售干红，涵盖美乐、赤霞珠、马瑟兰等主流欧亚葡萄品种，采集自新疆、宁夏、山西、河北产区。

 

2.2.总酚类分析

 

2.3.感官分析

 

2.4.SPI分析

 

2.5.响应面分析法（RSM）

 

2.6.统计分析

研究结果

 

3.1.关键唾液蛋白的筛选

共有12名评价员参与干红葡萄酒涩感评价，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）得到每位评价员全唾液（WS）蛋白图谱（图1）。12名评价员全唾液的蛋白组成整体相近，已鉴定蛋白条带汇总于表1，包含黏蛋白家族、富含脯氨酸蛋白（PRPs）等。但各类唾液蛋白的含量个体差异较大，例如α—淀粉酶（条带5、6）在P2、P4样本中含量高，而在P8样本中含量较低（图1）。此外，仅条带2、4、5、6、8、10、13可在全部评价员的全唾液样本中清晰检出，依次对应乳铁蛋白、白蛋白、α—淀粉酶、富含脯氨酸蛋白、溶菌酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂S。

 

 

将12名评价员的全唾液与5款葡萄酒样品开展结合反应，基于蛋白条带光密度下降值与涩感评分计算Kendall’s tau系数（Coeftau），以此表征各唾液蛋白评价涩感强度的灵敏度（表1）。当Coeftau＜0.05时，该蛋白与葡萄酒涩感存在显著相关性，条带强度损失率可较好反映葡萄酒涩感水平。同时，采用各蛋白家族占总唾液蛋白的损失百分率表征蛋白反应活性（图2）。高反应活性的关键蛋白家族在口腔中对单宁具备更强亲和力，参与单宁—蛋白相互作用的蛋白含量可表征涩感强度。

 

 

图2按照反应活性由高到低展示各蛋白家族。富含脯氨酸蛋白（PRPs，条带3、7、8、9、10、11、12）是参与该相互作用的主要唾液蛋白，平均反应活性为34.0%—35.8%，最高可达50.2%。条带8‑12在所有全唾液样本中丰度较高，出现显著Coeftau的评价员占总人数58.3%以上。上述结果说明富含脯氨酸蛋白在单宁—蛋白相互作用中亲和力高、起到关键作用。大量脯氨酸残基限制了富含脯氨酸蛋白的α‑螺旋结构占比，使该类蛋白分子尺寸偏大、疏水性较强，构象开放且柔性好。原花青素与脯氨酸残基之间可形成较强分子间相互作用，推动原花青素与蛋白发生选择性结合。

 

 

α—淀粉酶（条带5、6）对该相互作用贡献较大，反应活性介于26.7%—29.0%，同时该蛋白对样品涩感强度的表征灵敏度最高，可达75%。α‑淀粉酶对单宁良好的亲和能力与已有报道相符，但部分模拟体系研究表明，相较于牛血清白蛋白与黏蛋白，单一α—淀粉酶与原花青素的反应活性较低。单宁—蛋白相互作用过程复杂，不溶性聚集体由多种蛋白共同构成，不同唾液蛋白家族参与涩感形成的不同阶段。据此推测，α—淀粉酶可与其他唾液蛋白产生协同效应，提升自身对单宁的结合亲和力。

乳铁蛋白（条带2，8.5%—12.0%）与富含脯氨酸蛋白/溶菌酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（条带13，10.4%—12.4%）在总蛋白中的平均反应活性仅次于富含脯氨酸蛋白与α—淀粉酶。但唾液中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S对单宁反应活性弱，对整体反应贡献有限，二者分别有41.7%、75%的评价员样本得到显著Coeftau。

58.3%的评价员样本中白蛋白（条带4）得到显著Coeftau，但该蛋白在5款葡萄酒样品中的反应活性不高，仅为7.1%—7.8%。原因在于白蛋白呈紧凑的心形空间结构，对比构象开放柔性强的富含脯氨酸蛋白，其对单宁的亲和力更低。

P‑B肽/富酪蛋白（条带14）在唾液中含量低，因此总蛋白反应活性处于中等水平（6.0%‑7.9%），但仍有50%评价员样本中该条带光密度下降与涩感评分存在显著Coeftau。已有研究表明，PB肽脯氨酸残基占比高，归属于富含脯氨酸蛋白类，对单宁具备较高亲和力，由此产生上述现象。

黏蛋白家族（条带1）是唾液中丰度最高的蛋白之一，但SDS‑PAGE电泳无法在全部全唾液样本中将其清晰检出（图1）。黏蛋白家族反应活性（＜3.1%）与灵敏度（25%）在所有蛋白中最低。这可能是黏蛋白与口腔上皮细胞碎片、微生物结合形成唾液胶束，在全唾液前处理过程中大分子聚集体发生损失所导致。因此在唾液沉淀指数（SPI）检测中黏蛋白可提供的有效信息有限。另有文献报道，半胱氨酸蛋白酶抑制剂S、富酪蛋白等唾液蛋白在全唾液制备过程中也会选择性生成大分子聚合物，说明开展SPI分析时，这类蛋白很难参与单宁‑蛋白结合反应。

传统SPI检测仅选取α‑淀粉酶（条带6）与富含脯氨酸蛋白/溶菌酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（条带13）作为全唾液蛋白代表用于SPI数值计算。虽然传统SPI结果变化趋势与真实感官评价保持一致（图3B），但无法区分不同葡萄酒样品之间涩感强度的显著差异（图3A）。除此之外，富含脯氨酸蛋白、白蛋白、乳铁蛋白这类丰度高、对单宁‑蛋白反应活性与灵敏度优异的唾液蛋白并未纳入传统检测体系。以上说明缺失部分关键唾液蛋白信息会降低该方法的检测灵敏度。

 

 

为实现涩感强度准确、灵敏的评价，需要构建一套综合考量关键唾液蛋白组成、浓度及其反应活性的新型人工唾液体系。本研究选取富含脯氨酸蛋白、α—淀粉酶、乳铁蛋白、溶菌酶、白蛋白、P—B肽作为构建人工唾液的核心蛋白；采用商品化聚—L—脯氨酸替代天然富含脯氨酸蛋白，同时引入牛血清白蛋白，弥补真实唾液中白蛋白反应活性不足的缺陷。

 

3.2.人工唾液体系的优化

依据3.1节结果，选取富含脯氨酸蛋白、α—淀粉酶、乳铁蛋白、溶菌酶、白蛋白构建人工唾液。参考已有文献配置人工唾液缓冲体系，结合多篇文献报道的人体唾液真实蛋白水平，设定5种蛋白的浓度区间：聚—L—脯氨酸100—300 mg/L，α—淀粉酶300—500 mg/L，乳铁蛋白0—200 mg/L，溶菌酶0—50 mg/L，白蛋白0—250 mg/L。结合评价员唾液实测pH与文献报道，人工唾液pH优化区间设定为6.5—7.5。采用响应面法（RSM）对乳铁蛋白、溶菌酶、α—淀粉酶、牛血清白蛋白、聚—L—脯氨酸的浓度以及人工唾液pH开展优化。以多元线性回归得到的决定系数R2(Y)作为评价指标，表征5种蛋白光密度下降百分率与单宁浓度之间的相关程度。

优化实验所用缩合单宁（CT）溶液仅使用商品化单宁作为底物。干红葡萄酒中花青素含量较高，但花青素对涩感贡献较低，因此本优化过程不引入花青素。

正交实验设计表与拟合优度R2结果见表S1。对实验数据开展多元回归分析（图4），二阶函数无法实现良好模型拟合，而四次多项式方程可实现优异拟合效果。

 

 

采用方差分析（ANOVA）检验模型的适配度与可靠性。受单宁—​​​​​​​蛋白相互作用的复杂性影响，模型各项并非完全独立，存在多重共线性现象。具体而言，可溶性单宁—蛋白聚集体会在疏水作用力驱动下继续聚集，最终生成不溶性沉淀。由表S2与图4结果可知，X3（α—淀粉酶）系数不显著，证明在单宁—蛋白沉淀反应过程中，α—淀粉酶与其余唾液蛋综合响应面结果，人工唾液最优蛋白配比为：乳铁蛋白145.7 mg/L，溶菌酶19.3 mg/L，α—淀粉酶425.8 mg/L，牛血清白蛋白103.2 mg/L，聚—L—脯氨酸233.6 mg/L，体系pH调至6.6。

为验证优化后公式，分别对人工唾液—缩合单宁体系（缩合单宁1 g/L）、人工唾液—干红葡萄酒（1号样品）开展10组平行体外重复实验。测得缩合单宁结果分别为0.99±0.04 g/L、1.13±0.09 g/L，相对标准偏差依次为4.2%、8.4%，均小于10%，证明优化后人工唾液建立的SPI方法重复性良好。配置一系列梯度缩合单宁溶液（0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 g/L）测定ASPI，确定检出限。蛋白损失率结果见图S3，0.1 g/L与0.05 g/L缩合单宁组5种蛋白的损失率无显著差异，因此ASPI方法可精准检出的最低缩合单宁浓度为0.1 g/L，定量限为0.2 g/L，高于该浓度时所有蛋白均出现显著损失。

 

3.3.人工唾液沉淀指数（ASPI）与感官评价及其他分析方法对比

共计60款葡萄酒样品用于评估ASPI方法性能，由12名评价员完成全部样品涩感强度感官品评与打分。同时采用福林—丹尼斯法（FD）、福林—肖卡法（FC）、牛血清白蛋白单宁沉淀法（BSA）、甲基纤维素单宁沉淀法（MCP）与传统SPI方法开展对照分析。

由图5与表S5可见，基于人工唾液体系的ASPI方法与感官评分相关性最优，显著优于其余化学比色方法。FD法、FC法测得总酚含量分别为1.50—4.85 g/L、1.79—4.66 g/L，二者与感官评分皮尔逊相关系数拟合优度均低于0.2。MCP法测得酚类物质与感官评分相关系数为0.42，与FD、FC结果接近。上述方法均会高估花青素等涩感贡献弱的酚类组分带来的涩感强度。BSA法可排除花青素干扰，与感官评分相关性有所提升，但该方法会低估黄烷醇单体与二聚体的涩感贡献。

传统SPI方法与感官评分呈良好正相关，整体优于其余化学比色手段（图5），但与感官评分拟合优度仅0.43，结果仍不够理想。相比之下，ASPI的皮尔逊相关系数远高于传统SPI，拟合优度R2分别为0.88与0.43。该结果说明组分稳定的人工唾液优于采集得到的人体全唾液：一方面人工唾液体系引入乳铁蛋白、牛血清白蛋白等传统SPI未纳入的蛋白，获取更多相互作用信息，检测结果灵敏度与可靠性更高；另一方面消除了不同评价员全唾液带来的个体差异。人工唾液所用蛋白均为商品化试剂，使ASPI方法稳定性强，同时可作为通用方法测定干红葡萄酒涩感强度。

 

 

研究结论

 

为实现干红葡萄酒涩感强度精准、稳定的评价，本研究构建人工唾液体系替代传统SPI方法。该体系筛选乳铁蛋白、溶菌酶、α—淀粉酶、牛血清白蛋白、聚—L—脯氨酸5种唾液蛋白，借助响应面法优化人工唾液的蛋白组成、蛋白浓度以及体系pH。与其他方法相比，ASPI和感官评分相关性最高，同时具备良好重复性，既适用于实验室科学研究，也可应用于酒庄实际生产。人工唾液体系充分模拟口腔内单宁—蛋白结合真实环境，获得更加丰富的蛋白损失信息。该研究可为后续解析葡萄酒品鉴过程的涩感感知机制提供参考，助力解析不同阶段下单宁—蛋白、蛋白—蛋白之间的协同作用。