文献解读 1200 Anal. Chim. Acta.：立体化学如何影响葡萄酒的味道：南烛木树脂酚立体异构体的分离、表征和感官评价

文献解读  1200

立体化学如何影响葡萄酒的味道：南烛木树脂酚立体异构体的分离、表征和感官评价

期刊：Analytica Chimica Acta（6.1）

发表日期：2015年

引言

呈味活性分子数十年来一直是研究的主题。橡木是活性分子的另一个来源；在桶陈期间，挥发性和非挥发性化合物均从木材释放到葡萄酒中，从而高度改变葡萄酒的感官特性。最近，一种来自橡木、名为南烛木树脂酚的木脂素被证明具有苦味。另一项研究表明，南烛木树脂酚在新橡木桶陈酿的葡萄酒中的浓度高于其感知阈值（白葡萄酒中为1.5 mg/L），确立了其对橡木陈酿期间观察到的苦味增加的关键贡献。由于官能团可以调节葡萄酒分子的感官属性，人们也在橡木提取物中寻找南烛木树脂酚的天然衍生物。由此发现了没食子酰基、葡萄糖基和木糖基衍生物，其中一些表现出苦味，但强度低于南烛木树脂酚。

除官能团外，立体化学也对感官特性起着重要作用。这种重要性对于许多挥发性化合物已为人所知，其绝对构型影响香气的强度和性质（limonene的S-和R-对映体分别闻起来像柠檬和橙子）。同样，立体化学也影响味道属性。1886年，Piutti首次分离出D-天冬酰胺，即L-天冬酰胺的对映体，证明这些化合物分别味甜和无味。在这一发现之后，其他化合物也被证明会因其立体化学而具有不同味道特征。

有趣的是，南烛木树脂酚具有三个立体中心，提示可能存在八种立体异构体。在已分离出南烛木树脂酚的若干植物物种中，已观察到它以8R,8'R,7'S-和8S,8'S,7'R-对映体的混合物形式存在，且相对丰度可变。在栎属橡木中，比旋光度测量表明两种对映体以相似浓度存在。然而，它们各自的味觉特性从未被评估。此外，已在多种植物中鉴定出一些南烛木树脂酚非对映异构体。

因此，关于橡木中南烛木树脂酚异构体的存在及其感官特性，知识仍然缺乏。考虑到南烛木树脂酚在外消旋混合物中表现出强烈苦味，对此类立体异构体进行分离、表征和感官研究可能特别有意义。

因此，我们首先通过靶向筛查和以液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）为导向的逆流色谱（CCC）分离，在橡木提取物中寻找南烛木树脂酚非对映异构体。然后，通过水解橡木中存在的天然木糖苷衍生物，实施了一种原创的对映体拆分。分离出两种对映体，并首次通过手性光谱测量确定其绝对构型。评估了所有纯化化合物的味觉特性，并研究了它们在橡木桶陈酿葡萄酒中的存在，以探究南烛木树脂酚的立体化学是否可能影响葡萄酒味道。

 

材料与方法

 

2.1. 化学品与材料

本研究所用橡木为来自法国多个森林的Quercus petraea心材板条。板条经2年风干，然后加工成片状。本研究使用两种葡萄酒：一种未陈酿的2013年波尔多白葡萄酒（100% Sauvignon blanc，13% vol. alc.）用于感官测试；一种2012年Margaux红葡萄酒（90% Cabernet Sauvignon和10% Merlot，13.5% vol. alc.）在新法国橡木桶中陈酿15个月，用于化学分析。

 

2.2. 预纯化橡木提取物的制备、2.3. LC-HRMS分析、2.4. 离心分配色谱分级、2.5. 制备型高效液相色谱纯化、2.6. 南烛木树脂酚对映体的外消旋拆分、2.7. NMR实验、2.8. 偏振测定、2.9. 振动圆二色测量、2.10. 密度泛函理论计算

详见原文。

 

2.11. 纯化化合物的感官分析

化合物在由纯净去矿质水和蒸馏乙醇组成的水醇溶液中，以及在未陈酿白葡萄酒中品鉴。化合物以2 mg/L溶于12% vol. alc.水醇溶液中。样品由五位葡萄酒品鉴专家品鉴。要求他们使用葡萄酒品鉴词汇描述每种化合物的味觉感知，并在0（不可检测）到5（强烈可检测）的量表上评估苦味强度。

 

结果与讨论

 

3.1. 一种南烛木树脂酚异构体的证据与纯化

由于物理化学性质差异，结构异构体和非对映异构体可在非手性环境中分离。因此，将配备经典C18柱的超高效液相色谱（U-HPLC）与傅里叶变换质谱（FTMS）联用，通过靶向其去质子化离子C22H27O8对应的m/z 419.1712，寻找南烛木树脂酚的此类异构体。该MS技术对于在复杂基质中筛查未知化合物非常有效。

如图1所示，对水乙醇橡木提取物的分析显示，在m/z 419.1712周围5 ppm窗口记录的提取离子色谱图（XIC）中，保留时间2.69和2.85 min处有两个峰。对加入纯南烛木树脂酚储备溶液的同一样品进行分析，导致保留时间2.69 min处主峰强度增加，确定第一个峰为南烛木树脂酚（化合物1）。保留时间2.85 min处第二个峰的存在突显了橡木提取物中存在南烛木树脂酚的一种异构体（化合物2）。此类异构体从未在橡木中报道过。为纯化这种新异构体，开发了LC-HRMS程序。

 

 

经萃取以除去最极性化合物尤其是糖基化木脂素后，预纯化提取物通过离心分配色谱（CPC）进一步分级。选择合适的溶剂系统以最大化计算分配系数之间的差异。系统正庚烷/乙酸乙酯/乙腈/水 1:4:1.29:4 v/v效果最佳，化合物1和2的Kd分别为1.7和1.1。然而，考虑这些值，两种化合物不太可能完全分离，但可能获得富含目标化合物的馏分。进行两次连续进样以处理整个提取物。经LC-HRMS分析后，合并CPC管并冻干，制成一个富含南烛木树脂酚异构体的馏分。该馏分随后用优化梯度的制备型HPLC进行化合物分离。经LC-HRMS分析，分离出的南烛木树脂酚异构体纯度高于95%。

 

3.2. 南烛木树脂酚非对映异构体的结构与感官分析

为阐明该南烛木树脂酚异构体的化学结构，进行了1D和2D NMR实验（详见补充材料）。最终结果确定纯化分子是南烛木树脂酚的一种非对映异构体（化合物2），其相对构型与南烛木树脂酚的差异在于C-7'位置的差向异构化，如图2所示。该非对映异构体已由Ohashi等在Aegle marmelos树皮中鉴定，在此研究首次在栎属中鉴定。

 

 

基于文献和旋光度的测定，表南烛木树脂酚 2在橡木中似乎以两种对映体形式的混合物存在，但左旋形式过量。与南烛木树脂酚不同，表南烛木树脂酚在葡萄酒中的存在迄今尚未被描述。本研究首次在葡萄酒中鉴定出表南烛木树脂酚。

鉴于南烛木树脂酚 1的感官特性及其苦味感知阈值评估为1.5 mg/L，我们决定分析表南烛木树脂酚的味道感知。因此，表南烛木树脂酚 2以2 mg/L在12% vol. alc.水醇溶液以及未陈酿白葡萄酒中品鉴。专家将其味道描述为与对照介质溶液相比不苦且仅略带甜味。

考虑这些结果以及橡木和橡木桶陈酿葡萄酒中表南烛木树脂酚相比南烛木树脂酚含量较低，表南烛木树脂酚似乎不太可能影响葡萄酒味道。因此，未对该化合物或其对映体形式进行进一步研究。

 

3.3. 南烛木树脂酚的对映体拆分

使用C18柱对橡木提取物进行LC-HRMS分析，揭示了两种非对映异构体的存在：南烛木树脂酚 1和表南烛木树脂酚 2。然而，据报道橡木中南烛木树脂酚 1的比旋光度接近零，表明提取化合物中是两种对映体1a和1b的混合物（图2）。因此，迄今为止所有关于南烛木树脂酚的感官研究均使用从橡木中纯化的外消旋混合物进行，每种对映体的特性从未被单独评估。通常，外消旋体拆分使用手性柱HPLC在制备规模上进行，但此类柱非常昂贵。另一种方法是先用相同手性部分衍生化对映体，以获得可通过非手性色谱分离的非对映异构体。分离后，每种非对映异构体可水解以得到目标对映体。

在本研究中，我们决定通过分离和水解天然衍生化非对映异构体来拆分南烛木树脂酚外消旋混合物。事实上，先前研究已确定橡木中存在南烛木糖甙（lyoniside） 3和努迪泊苷（nudiposide） 4，分别是(+)-和(−)-南烛木树脂酚的两种天然吡喃木糖苷衍生物。为此，将如前所述纯化的南烛木糖甙（lyoniside） 3和努迪泊苷（nudiposide） 4在惰性气氛下于酸性条件加热，以水解木糖醛与南烛木树脂酚伯醇（C9'）之间形成的缩醛，如图3所示。使用TFA酸化溶液，因为它可容易地从粗反应混合物中真空除去。

 

 

通过LC-HRMS监测水解，以确保反应完全，南烛木糖甙（lyoniside） 3和努迪泊苷（nudiposide） 4通过从苷元上裂解吡喃木糖而完全消失，生成南烛木树脂酚对映体1a和1b以及吡喃木糖副产物。

对每种粗反应混合物进行制备型HPLC，通过除去所有副产物来纯化1a和1b。(+)-和(−)-南烛木树脂酚对映体的纯化百分比产率分别为44.6%和43.5%。每种纯化对映体使用分析型手性柱通过手性液相色谱分析。如图4所示，注入(±)-南烛木树脂酚 1显示5.88 min和7.16 min两个峰，而纯化的(+)-和(−)-南烛木树脂酚对映体分别在5.92 min和7.17 min仅呈现一个峰，确认了外消旋拆分的效率。

 

 

3.4. 南烛木树脂酚对映体绝对构型的确定

对每种对映体进行1D和2D NMR实验以确认其相对构型。(+)-和(−)-南烛木树脂酚对映体的1H NMR谱与(±)-南烛木树脂酚 1的谱图叠加，NMR数据与文献报道的南烛木树脂酚一致。1的相对构型基于H-2'（H-6'）/H-8'和H-7'/H-8之间的ROEs相关建立，提示H-7'和H-8'为反式取向，且H-7'和H-8为同面。每种对映体的比旋光度测得为+43和−45。这些值相似且符号相反，确认了它们的对映体关系。由于南烛木树脂酚的两种对映体已成功分离，我们决定确定其绝对构型。

(+)-南烛木树脂酚的绝对构型此前通过降解反应并与已知化合物比较，被提出为(8R,8'R,7'S)，(−)-南烛木树脂酚为对映体。然而，南烛木树脂酚的绝对构型从未通过手性光谱实验（电子或振动圆二色）结合理论计算得到确认。在本研究中，我们使用振动圆二色（VCD），这是一种确定溶液中手性分子绝对构型和构象的成熟方法。该方法需要将测量的VCD光谱与在密度泛函理论（DFT）水平上针对指定绝对构型计算的光谱进行比较。由于对映体在每个振动模式上具有相反符号的VCD带，VCD光谱提供了绝对构型的独特丰富特征。

两种南烛木树脂酚对映体的VCD光谱在DMSO-d6中以50 mM浓度记录，见图5。两个光谱相对于基线相反，确认这两种分子是对映体。对(8R,8'R,7'S)-南烛木树脂酚（图2中的化合物1a）进行理论计算，以确定(+)-和(−)-南烛木树脂酚的绝对构型。1a的构象分析最初使用半经验RM1计算结合模拟退火技术进行。保留72个能量在最低能量构象3 kcal/mol以内的1a构象。随后，使用DFT在B3PW91/6-311G**水平优化72个RM1构象。在同一水平计算谐振动频率，以确认所有结构均为稳定构象，并能够计算自由能。基于(8R,8'R,7'S)-南烛木树脂酚相对布居预测的VCD光谱与(+)-和(−)-南烛木树脂酚的实验VCD光谱比较（图5）。预测的(8R,8'R,7'S)-南烛木树脂酚异构体VCD光谱较好的再现了(+)-南烛木树脂酚实验光谱中大多数带的强度和符号，确认了此前文献提出的(8R,8'R,7'S)-南烛木树脂酚绝对构型。

 

 

3.5. 对映体的味觉特性及其对葡萄酒味道的影响

为测量每种南烛木树脂酚对映体对其外消旋混合物1苦味感知的味觉影响，将对映体1a和1b以2 mg/L在12% vol. alc.水醇溶液中品鉴，并与对照介质溶液比较。在未陈酿白葡萄酒中也品鉴了相同浓度。专家首次描述南烛木树脂酚 1a表现出强烈苦味，相当于4 mg/L的(±)-南烛木树脂酚 1的苦味，而南烛木树脂酚 1b无味。因此，(±)-南烛木树脂酚 1的苦味来自(+)-南烛木树脂酚 1a，而(−)-南烛木树脂酚 1b不参与。最后，使用配备手性柱的LC-HRMS分析橡木桶陈酿的玛歌葡萄酒，以寻找南烛木树脂酚对映体的存在。对南烛木树脂酚特异m/z比的XIC显示5.94和7.15 min两个峰，分别对应南烛木树脂酚对映体1a和1b（图6）。加标样品分析确认(+)-南烛木树脂酚 1a和(−)-南烛木树脂酚 1b均存在于该橡木桶陈酿红葡萄酒中，相对丰度与橡木中观察到的相似。鉴于这些结果以及两种对映体的味觉特性，似乎只有(+)-南烛木树脂酚 1a可能通过增加苦味影响葡萄酒味道。

 

 

结论

 

本研究聚焦于使用分析技术突显立体化学与南烛木树脂酚感官特性之间的关系。使用以LC-HRMS为导向的CCC分离程序，首次在栎属中鉴定出一种非对映异构体表南烛木树脂酚。此外，通过从天然衍生物进行外消旋拆分，分离出南烛木树脂酚的两种对映体。这种原创方法对天然产物似乎很有前景，因为它比手性分离更便宜，并且比对映选择性合成更符合绿色化学趋势。这种外消旋拆分首次通过VCD测量结合DFT计算，确定了两种对映体的绝对构型。通过LC-HRMS分析，在橡木桶陈酿葡萄酒中确认了所有这些南烛木树脂酚立体异构体的存在。最后，进行感官分析以确定其味觉特性。(+)-南烛木树脂酚表现出强烈苦味，其对映体无味，表南烛木树脂酚略带甜味。这些结果表明，立体化学强烈影响葡萄酒化合物的味道，进而影响消费者的感知。

 

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