文献解读 1201 Food Chem：探究影响桃红与白葡萄酒生产中羟基酪醇的因素：品种选择、栽培管理及酵母

文献解读  1201

 

探究影响桃红与白葡萄酒生产中羟基酪醇的因素：品种选择、栽培管理及酵母

期刊：Food Chemistry（10.4）

发表日期：2026年

 

 

摘要

 

羟基酪醇（HT）是一种低毒且具备多种生物活性的抗氧化物质。本研究选用多个葡萄品种（包含1个有机栽培品种），结合不同酵母接种方案，分析桃红、白葡萄酒酿造过程中羟基酪醇的天然生成水平。本研究对超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）检测方法进行验证，用于测定羟基酪醇及其相关化合物。本研究在西班牙南部采收6个红葡萄品种和7个白葡萄品种，测试商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及野生酵母。主要研究结果：Rome品种桃红葡萄酒的羟基酪醇含量（1800 ng/mL）高于Mantuo de Pilas品种白葡萄酒（300 ng/mL）。有机葡萄产生的羟基酪醇最高为常规葡萄的5倍。此外，相较于商业酵母，野生酵母能够促进羟基酪醇生成。另外，酒泥与皮渣中留存大量羟基酪醇。综上，酿造过程中羟基酪醇的天然生成量会随葡萄品种与发酵工艺的不同而产生差异。

 

引言

 

羟基酪醇（HT）是一类苯乙醇物质（3,4二羟基苯乙醇），存在于橄榄、初榨橄榄油以及葡萄酒等食品中。Di Tommaso等人于1998年首次报道，红葡萄酒与白葡萄酒中均含有羟基酪醇，其中红葡萄酒中浓度约4.0 mg/L，白葡萄酒约1.9 mg/L。

羟基酪醇是强效抗氧化剂，也是广为人知的低毒生物活性化合物。基于它的抗氧化特性，已有研究尝试向葡萄酒中添加羟基酪醇，以此降低二氧化硫（SO₂）的使用量；二氧化硫是葡萄酒酿造中传统使用的抗氧化剂与抗菌剂。在各类降低二氧化硫的研究策略中，科研人员测试了添加多酚提取物的方案。具体来说，研究人员按照与二氧化硫相同的添加剂量，将羟基酪醇提取物应用于红葡萄酒生产，同时也用于制备无二氧化硫白葡萄酒。已有研究探究了该物质维持红、白葡萄酒品质的效果。虽然葡萄酒装瓶时品质合格，但在陈酿阶段品质劣变速度会明显加快。这是因为葡萄酒内部天然羟基酪醇的浓度不足以在酿造环节替代二氧化硫。

但在上述研究当中，所用提取物来源于橄榄工业副产物，或是标准品本身带有油腻特性，会改变葡萄酒的挥发性组分以及感官特征。因此，提高葡萄酒自身组分中的天然羟基酪醇含量，是减少甚至去除二氧化硫的可行策略，尤其考虑到葡萄酒本身就含有该物质。因此，本研究旨在探究能够提升葡萄酒天然羟基酪醇含量的条件，生产羟基酪醇浓度更高的葡萄酒，进而减少二氧化硫的使用。

已有研究表明，酒精发酵阶段酵母的作用，是羟基酪醇生成过程中的关键环节。本课题组已经证实，在合成葡萄汁进行酒精发酵时，葡萄酒酵母的胞内、胞外组分均存在羟基酪醇。羟基酪醇的一条潜在生成途径为：埃利希途径生成酪醇，酪醇在酪氨酸羟化酶的催化下发生羟基化反应；该反应和动物体内L酪氨酸羟基化生成L多巴的过程类似。酪醇是酵母在酒精发酵过程中合成的高级醇之一，合成存在两条可能途径：（1）合成代谢途径；（2）埃利希途径。

埃利希途径起始于氨基酸酪氨酸的转氨基反应；丙酮酸脱羧酶对羟基苯丙酮酸进行脱羧；醇脱氢酶将对羟基苯乙醛还原为直接前体物质酪醇；最后再经羟基化得到羟基酪醇。据此有推论认为：酪氨酸浓度越高，羟基酪醇的生成量也就越高。但RebolloRomero等人此前的研究表明，酪氨酸含量升高和羟基酪醇浓度升高不存在相关性，说明前文提到的合成代谢途径同样参与该过程。

酿酒酵母菌株发酵合成葡萄汁时可以生成羟基酪醇。在所测试的菌株中，酿酒酵母“Red Fruit”菌株的生成能力最强，产量是排名第二菌株的2倍。经液相色谱质谱检测得到，白葡萄酒中羟基酪醇的含量范围为0.0891.3 mg/L。

GonzalezRamirez等人2024年的研究证实，葡萄酒酒精度越高，羟基酪醇浓度越高。因此有必要研究温暖气候条件下种植的葡萄，这类葡萄的糖分含量高，能够酿造出酒精度更高的葡萄酒。本研究针对温暖气候条件下种植、分别采用常规和有机两种生产模式的不同葡萄品种，探究其酿造的白葡萄酒与桃红葡萄酒中的羟基酪醇及其相关化合物。此外，借助经验证的超高效液相色谱串联质谱技术，追踪上述化合物在各个酿造工序（包括接种、发酵）中的生成过程，研究酿造副产物（皮渣、酒泥）中该类物质的含量，具备研究价值。

 

材料与方法

 

详见原文。

 

结果与讨论

 

3.1色谱测定结果

采用超高效液相色谱串联质谱测定羟基酪醇生成相关化合物。标准品的保留时间和精确质量数可用于化合物准确定性。因此，质谱条件的优化对于所有化合物的准确定量至关重要。

根据GonzalezRamirez等人2024年的前期研究，羟基酪醇在负离子模式下检测；本研究针对羟基酪醇、酪醇、羟基苯丙酮酸、羟基苯乙醛、羟基苯乙酸均使用电喷雾负离子模式；酪氨酸则使用正离子模式。最终选定参数详见表S.3。定量离子与定性离子和GonzalezRamirez等人2024年报道保持一致。锥孔电压、碰撞能根据本研究所使用仪器进行调整。

在该色谱条件下，色谱峰分离效果良好，见图S.4。5种待测化合物的出峰顺序和前人报道一致。表S.4为本研究桃红葡萄酒的方法学验证参数。结果显示，校准曲线相关系数\(R^2\)介于0.99590.9996，线性关系良好；检出限、定量限数值较低。同时测定重复性、日内、日间精密度。重复性结果：高浓度范围相对标准偏差26%；中浓度511%；低浓度58%，符合美国官方分析化学家协会给出的范围要求（100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL对应的允许上限分别为15%、21%、30%）。

葡萄酒基质组分复杂。基质内其余物质会造成离子抑制或者离子增强，显著干扰电离，影响信号，改变其余验证参数。行业普遍认为基质效应20%~+20%为可接受范围；±2050%属于中等基质效应；大于50%属于强基质效应。基质效应为负值代表仪器检测信号降低。已有文献证实，电喷雾质谱信号强弱，和电喷雾源中其它电解质的存在密切相关。部分文献提出，样品稀释可以消除或者降低基质效应。因此，本研究取Rome、Tintilla de Rota成品桃红葡萄酒，二者的混合样品，以及Tintilla de Rota葡萄汁酒精发酵过程不同糖浓度阶段的样品，进行稀释处理，考察基质效应。

本研究结果与Guerrero等人2020年的结果一致：经过稀释后，全部化合物的检测信号均优于未稀释样品（表1）。模拟葡萄酒体系的1/20稀释条件下，除酪氨酸回收率介于3872%，其余物质回收率均接近100%。表1列出不同样品的回收率结果。可以观察到：未稀释样品的密度越高，回收率越差。因此稀释是高糖条件下抵消基质效应的有效手段。已有针对葡萄酒中二苯乙烯类物质的研究报道，最优稀释比例是1/10，可以最大限度降低电离抑制。但是本研究针对本次的目标化合物与高糖基质，最优稀释比例为1/20。由此说明，针对每一类化合物和对应的基质，都需要测试基质效应以及合适的稀释倍数（表1）。

 

 

由于大部分待测化合物具有抗氧化特性，本研究设置不同储存条件（4 ℃储存1天；‑20 ℃储存7天；‑80 ℃储存30天；自动进样器放置24 h）评估化合物稳定性。由表1、表2结果可以看出，在4 ℃、‑20 ℃、‑80 ℃条件下，所有化合物回收率良好，稳定性合格。

 

 

3.2桃红葡萄酒与白葡萄酒发酵过程羟基酪醇衍生物的测定

发酵样品使用模拟葡萄酒按照1/20比例稀释后，再进行超高效液相色谱串联质谱检测。如图S.5所示，所有实验中，酒精发酵初期（密度1929 g/L-1839 g/L），前体物质酪氨酸就已经被消耗完毕。RebolloRomero等人2020年曾经推测，合成葡萄汁的初始酪氨酸含量越高，发酵产生的羟基酪醇就越多。但本实验结果不支持该假设。本研究中，葡萄原料的酪氨酸含量和最终羟基酪醇浓度不存在相关性。线性回归分析显示，酪醇变量和初始酪氨酸存在相关性（p＜0.05），证明酪醇通过埃利希途径由酪氨酸生成。该结果与利用同位素标记酪氨酸开展合成葡萄汁发酵的相关文献结论一致。这表明，羟基酪醇和酪醇虽属于酪氨酸衍生的次级代谢产物，但二者绝大部分并非来自葡萄汁本身含有的酪氨酸。近期，利用标记葡萄糖的实验证实，羟基酪醇主要由葡萄糖合成，该合成通路涉及儿茶酚与L多巴，这可以解释本研究得到的实验结果。

羟基苯丙酮酸合成之后，在密度约15091326 g/L时达到浓度峰值（1500-11000 ng/mL），之后参与后续代谢步骤被消耗；桃红葡萄酒中该物质浓度高于白葡萄酒（数据未展示）。与之相反，羟基苯乙酸、酪醇的含量随发酵推进逐步升高；发酵结束时羟基苯乙酸最高可达100 ng/mL，酪醇最高可达50000 ng/mL（图S.6）。羟基酪醇在密度1929 g/L时就已经有明显检出；在整个发酵过程中含量保持稳定，全部发酵样品中该物质的数值处于400-1400 ng/mL区间。

无论是桃红葡萄酒还是白葡萄酒，所有化合物的生成模式均相近。但桃红葡萄酒羟基酪醇浓度（1800 ng/mL）高于白葡萄酒（300 ng/mL）；桃红组Rome品种羟基酪醇最高，白葡萄组Mantuo de Pilas品种最高（图1.1、图1.2、图2）。葡萄品种对于羟基酪醇生成存在显著影响。桃红葡萄酒羟基酪醇含量高于白葡萄酒，主要原因来自葡萄果皮中的酚类前体物质，以及酿造过程的浸皮时长。红葡萄果皮含有更多多酚类、羟基肉桂酸衍生物，在浸渍和陈酿阶段可以通过酶促或者氧化反应转化为酚类物质；白葡萄酒在发酵前就去除果皮，物质溶出与氧化反应程度很低。

 

 

据我们所知，本研究是首次对白葡萄酒、桃红葡萄酒酿造全过程，测定酪醇、羟基酪醇的相关化合物。此前已有部分研究，仅针对不同白葡萄品种的羟基酪醇开展检测。有文献使用同样的酿酒酵母Aroma White菌株测得：Palomino Fino羟基酪醇约100 ng/mL，Vijiriega约250 ng/mL。本研究证实，葡萄汁自然发酵体系中羟基酪醇产量，比合成葡萄汁体系高出100倍，该现象和前人文献报道保持一致。

多种因素会造成羟基酪醇产量提升。为进一步解析葡萄酒组分和羟基酪醇浓度的关系，开展统计学分析，纳入苹果酸、酒石酸、乳酸、最终酒精度这些参数。线性回归分析证实羟基酪醇浓度与酒精度存在相关性，和前人研究结果保持一致。但相关性最强的参数是苹果酸。深入分析表明，苹果酸和羟基酪醇呈负相关（R^²=0.8684，95%置信区间）。葡萄来源的苹果酸进入酵母细胞后，会转化为丙酮酸。L苹果酸是酵母细胞不同亚细胞区室参与C3、C4碳代谢的关键中间物；它的生化去向取决于细胞代谢需求，可以发生氧化、脱水或者脱羧反应。L苹果酸氧化生成草酰乙酸，进入三羧酸循环，或是经磷酸烯醇式丙酮酸参与糖异生；L苹果酸脱羧生成丙酮酸，丙酮酸是氨基酸合成和其它合成代谢途径的核心前体。已有文献报道，丙酮酸参与羟基酪醇的生成。苹果酸含量受品种影响，同时受气候条件强烈影响；温度高于30 ℃时，苹果酸发生分解，主要生成糖类。这就可以解释：苹果酸发生分解消耗的同时，羟基酪醇的浓度随之升高。

 

3.3不同酵母接种方式对羟基酪醇及其相关化合物的影响

选取Garrido Fino、Vijiriega、有机Palomino Fino、常规Palomino Fino葡萄，分别使用商业酵母、筛选得到的野生酵母（提前制备起始培养物；Garrido Fino使用C12；Vijiriega使用V7；常规Palomino Fino使用V9；有机Palomino Fino使用C2）进行发酵（部分数据未展示）。商业酵母发酵得到葡萄酒的羟基酪醇含量更低；野生酵母发酵组的羟基酪醇含量显著更高。以Vijiriega葡萄为例，V7野生酵母发酵所得葡萄酒的羟基酪醇浓度最高可以达到商业酵母组的2倍。该结果进一步证明，相比于直接接种商业酵母，野生酵母能够生成更多代谢产物。对于酪醇、羟基苯丙酮酸，野生酵母接种组的浓度同样高于商业酵母组。

野生酿酒酵母以及非酿酒酵母，相较于商业酵母，通常可以生成种类更丰富、浓度更高的高级醇。该差异主要来源于埃利希途径的活性区别；本土菌株的氨基酸分解代谢能力更强，因此杂醇类物质生成量更高。

 

3.4有机葡萄发酵过程羟基酪醇及相关化合物特征

近些年，消费者对于食品当中化学残留物质的关注度显著上升，大量葡萄园开始采用有机葡萄种植模式。有机、常规种植模式的葡萄品种，会对葡萄酒最终组分产生影响。本研究对有机模式、常规模式种植的Palomino Fino葡萄开展发酵实验。有机种植葡萄酿造酒的羟基酪醇浓度最高达到常规组的5倍，差异具有统计学意义（p＜0.05，图3）。其余化合物变化趋势保持一致，有机组的酪氨酸、酪醇、羟基苯乙酸、羟基苯丙酮酸浓度均更高。已有文献对Monastrell品种有机、常规葡萄的酚类物质开展分析：采收前一个月有机葡萄总酚（974.2±54.4 mg/kg）高于常规葡萄（447.7±27.8 mg/kg）；但到采收期，二者的该类差异消失。另有文献测定，常规种植葡萄总酚1.82 mg/L，有机种植葡萄为2.03 mg/L。但这类效应会随葡萄品种不同而存在较大差异。

 

 

3.5酿造副产物中的羟基酪醇含量

已有文献证实酵母可以生成羟基酪醇。另有文献发现在发酵前阶段就已经存在其它生物活性物质，因此本研究测定葡萄皮渣样品中的羟基酪醇。

红葡萄皮渣羟基酪醇（546.53±206.58 ng/mL）高于白葡萄皮渣（246±104 ng/mL），二者差异具有统计学意义（p＜0.05）。该结果和接种酵母之后，酿造初期葡萄酒的羟基酪醇水平保持一致。有机葡萄皮渣羟基酪醇浓度（321.42±12.14 ng/mL）高于常规葡萄皮渣（70.75±5.32 ng/mL）；该规律和葡萄酒成品羟基酪醇含量相吻合：桃红葡萄酒与有机葡萄酒的羟基酪醇含量最高。副产物样品检出羟基酪醇可以说明：羟基酪醇不仅仅由酵母生成；在接种酵母之前，葡萄原料本身就含有羟基酪醇。已有文献报道，葡萄水提物中可以检测出羟基酪醇（0.05 μg/g）。

对白葡萄酒发酵酒泥测定羟基酪醇，含量为28.35±11.25 ng/mL；桃红葡萄酒发酵酒泥为7.58±0.79 ng/mL，二者差异具有统计学意义（p＜0.05）。Garrido Fino商业酵母组酒泥的羟基酪醇数值最高（98.60±36.90 ng/mL）。该结果看似与“桃红葡萄酒成品羟基酪醇含量更高”这一现象相矛盾；据此我们可以推断：“Aroma White”酵母发酵产生的酒泥，比“Red Fruit”酵母发酵的酒泥能够留存更多羟基酪醇。

野生酵母、商业酵母发酵得到的酒泥之间同样存在差异。商业酵母组酒泥羟基酪醇（42.91±16.59 ng/mL）高于野生酵母组（13.76±5.66 ng/mL），差异显著。这和前面的结论相吻合：野生酵母发酵得到的成品葡萄酒羟基酪醇含量更高。

除羟基酪醇之外，酿造副产物中还检出血清素、褪黑素。酿酒副产物不仅可以实现可持续再利用、提升产品附加值，还可以用于开发品质与功能特性得到改善的新型食品原料。

需要指出，大量酚类提取物质最终会进入葡萄酒行业废弃副产物。全球每年会产生2000万吨酿酒副产物，酒泥就是其中一类。酿造副产物凭借自身潜在活性可以实现价值再造，参与“循环生物经济”。

 

结论

 

经验证的超高效液相色谱串联质谱分析方法可以实现羟基酪醇的准确定量；1:20的最优稀释倍数可以有效降低基质效应。本研究主要结论之一是：糖类会显著引发基质效应。因此，想要削弱基质效应，稀释操作必不可少；该思路不仅适用于葡萄汁、葡萄酒，同样可以推广应用于水果及其果汁样品。

本研究证实，桃红葡萄酒、白葡萄酒天然含有羟基酪醇；桃红葡萄酒羟基酪醇浓度显著更高。葡萄品种（桃红代表Rome，白葡萄代表Mantuo de Pilas）、栽培模式（有机对比常规）、发酵工艺，均显著影响羟基酪醇水平。葡萄自带的苹果酸会影响最终羟基酪醇浓度。有机葡萄汁生成羟基酪醇最高可达常规葡萄的5倍；和接种商业酵母相比，野生酵母发酵可以得到更高的羟基酪醇含量。

此外，酒泥等葡萄酒副产物可以检出一定含量的羟基酪醇，具备进一步资源化开发的潜力。以上结果表明：挑选合适葡萄品种、采用有机栽培模式以及使用野生酵母，是酿造过程降低二氧化硫的关键手段；羟基酪醇作为葡萄酒原生生物活性物质，在替代传统防腐、抗氧化工艺方面拥有良好的应用前景。

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